Identificação de casos de transferência horizontal de genes em B. xylophilus

Mestrado em Biotecnologia MolecularA doença da murchidão do pinheiro foi identificada pela primeira vez no Japão em 1905 e foi associada ao nemátodo Bursaphelenchus xylophilus em 1972. A devastação provocada por esta doença, assim como as perdas económicas a ela associadas e o impacto na fileira florestal levaram a Organização Europeia para a Proteção das Plantas a declarar o nemátodo da madeira do pinheiro como uma praga. Atualmente já existe informação extensa sobre a morfologia, ciclo de vida, associação com um vetor e potenciais hospedeiros para este organismo. No entanto, o mecanismo molecular da doença é pouco conhecido, mas um dos fatores apontados, passa pela aquisição de novas funções por incorporação horizontal de genes. O transcriptoma de B. xylophilus foi sequenciado e anotado recentemente no Biocant, gerando um grande volume de dados. O objetivo do nosso trabalho foi identificar novos genes incorporados no genoma do nemátodo por transferência horizontal. Para levar a cabo esta tarefa, foi estabelecido um pipeline de análise de dados contendo um conjunto sequencial de filtros usados para remover genes com origem em nemátodos e reter os de origem bacteriana ou fúngica. Os transcritos de B. xylophilus anotados foram também filtrados de acordo com as funções dos genes e pelo E-value. Uma última filtragem foi realizada tendo por base a composição da comunidade microbiana associada ao nemátodo, obtida por pirosequenciação. O pipeline definido gerou 21 candidatos que foram validados através de análise filogenética com proteínas homólogas de bactérias, fungos, nemátodos e outros organismos e ainda com uma posterior identificação do gene no genoma do nemátodo, disponibilizado no decurso deste trabalho. Esta abordagem identificou três genes incorporados por transferência horizontal: uma β-1,3-endoglucanase, uma álcool desidrogenase, e um gene que pertence à família das desidrogenases/redutases de cadeia curta. Os primeiros dois genes já foram descritos em B. xylophilus e C. elegans, respetivamente, o que valida a nossa abordagem. O papel que o gene recém-identificado desempenha no nemátodo e na doença terá de ser estudado futuramente, na expectativa deste fornecer novas informações sobre o mecanismo da doença e novos alvos elegíveis para o controlo da doença.Pine wilt disease was first identified in Japan in 1905 and its association with the nematode Bursaphelenchus xylophilus dates back to 1972. The devastating nature of this disease and the big economical losses it generates along with the ecological impact led the European Plant Protection Organization to consider its causal agent as an european quarantine pest. Until now, information regarding the nature of B. xylophilus with reference to its morphological characters, life cycle, vector association and potential host have been gathered and documented. However, little is known on the molecular mechanisms of the disease. According to current knowledge one of the factors that may play a role in the disease is the acquisition of new gene functions through horizontal gene transfer (HGT). The transcriptome of B. xylophilus was recently sequenced and annotated at Biocant, providing a large amount of genomics information. The goal of our work was to identify new genes incorporated through HGT in these transcripts. To accomplish our objective we established a data analysis pipeline composed of several filters to discard genes of nematodal origin and select only those of bacterial or fungal origin. B. xylophilus transcripts were screened based on the information held in their annotation: E-value, organism origin and existence of a specific function. A final screen was performed by removing all hits matching the microbial community associated with the nematode, as determined by barcoded pyrosequencing. The pipeline outlined 21 candidates that were compared to homologous sequences from bacteria, fungi, nematodes and other organisms through phylogenetic analysis. This last step confirmed the presence of three genes resulting from HGT a β-1,3- endoglucanase, an alcohol dehydrogenase and a short chain dehydrogenase/reductase. The first two genes were already described for B. xylophilus and C. elegans, respectively, validating our approach. The role of the newly identified HGT gene in the nematode and disease will be studied in the future, expecting to provide new information on the disease mechanism and contribute to the identification of new targets eligible for disease control