Estudos metabonómicos sobre a qualidade e estabilidade da cerveja

Doutoramento em QuimicaThe work reported in this thesis aimed at applying the methodology known as metabonomics to the detailed study of a particular type of beer and its quality control, with basis on the use of multivariate analysis (MVA) to extract meaningful information from given analytical data sets. In Chapter 1, a detailed description of beer is given considering the brewing process, main characteristics and typical composition of beer, beer stability and the commonly used analytical techniques for beer analysis. The fundamentals of the analytical methods employed here, namely nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, gas-chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and mid-infrared (MIR) spectroscopy, together with the description of the metabonomics methodology are described shortly in Chapter 2. In Chapter 3, the application of high resolution NMR to characterize the chemical composition of a lager beer is described. The 1H NMR spectrum obtained by direct analysis of beer show a high degree of complexity, confirming the great potential of NMR spectroscopy for the detection of a wide variety of families of compounds, in a single run. Spectral assignment was carried out by 2D NMR, resulting in the identification of about 40 compounds, including alcohols, amino acids, organic acids, nucleosides and sugars. In a second part of Chapter 3, the compositional variability of beer was assessed. For that purpose, metabonomics was applied to 1H NMR data (NMR/MVA) to evaluate beer variability between beers from the same brand (lager), produced nationally but differing in brewing site and date of production. Differences between brewing sites and/or dates were observed, reflecting compositional differences related to particular processing steps, including mashing, fermentation and maturation. Chapter 4 describes the quantification of organic acids in beer by NMR, using different quantitative methods: direct integration of NMR signals (vs. internal reference or vs. an external electronic reference, ERETIC method) and by quantitative statistical methods (using the partial least squares (PLS) regression) were developed and compared. PLS1 regression models were built using different quantitative methods as reference: capillary electrophoresis with direct and indirect detection and enzymatic essays. It was found that NMR integration results generally agree with those obtained by the best performance PLS models, although some overestimation for malic and pyruvic acids and an apparent underestimation for citric acid were observed. Finally, Chapter 5 describes metabonomic studies performed to better understand the forced aging (18 days, at 45 ºC) beer process. The aging process of lager beer was followed by i) NMR, ii) GC-MS, and iii) MIR spectroscopy. MVA methods of each analytical data set revealed clear separation between different aging days for both NMR and GC-MS data, enabling the identification of compounds closely related with the aging process: 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF), organic acids, γ-amino butyric acid (GABA), proline and the ratio linear/branched dextrins (NMR domain) and 5-HMF, furfural, diethyl succinate and phenylacetaldehyde (known aging markers) and, for the first time, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4(H)-pyran-4-one xii (DDMP) and maltoxazine (by GC-MS domain). For MIR/MVA, no aging trend could be measured, the results reflecting the need of further experimental optimizations. Data correlation between NMR and GC-MS data was performed by outer product analysis (OPA) and statistical heterospectroscopy (SHY) methodologies, enabling the identification of further compounds (11 compounds, 5 of each are still unassigned) highly related with the aging process. Data correlation between sensory characteristics and NMR and GC-MS was also assessed through PLS1 regression models using the sensory response as reference. The results obtained showed good relationships between analytical data response and sensory response, particularly for the aromatic region of the NMR spectra and for GC-MS data (r > 0.89). However, the prediction power of all built PLS1 regression models was relatively low, possibly reflecting the low number of samples/tasters employed, an aspect to improve in future studies.O trabalho apresentado nesta tese pretendeu aplicar a metodologia usualmente designada por metabonómica, baseada na utilização de métodos de análise multivariada (MVA) para extrair a informação relevante de conjuntos de dados, obtidos por técnicas analíticas, no estudo detalhado de um determinado tipo de cerveja e seu controlo de qualidade. No Capítulo 1, é apresentada uma descrição detalhada sobre cerveja: seu processo de fabrico, principais características e composição típica, estabilidade da cerveja e principais técnicas utilizadas para o estudo da composição da cerveja e do seu controlo de qualidade. Os fundamentos teóricos das técnicas analíticas utilizadas no decorrer da tese, nomeadamente espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) e espectroscopia de infravermelho-médio (MIR), conjuntamente com uma descrição da metodologia de metabonómica estão descritos no Capítulo 2. No Capítulo 3, está descrita a aplicação de RMN de alta resolução para caracterizar detalhadamente a composição química de um tipo de cerveja. O espectro de RMN de 1H obtido pela análise directa de cerveja apresenta uma elevada complexidade, confirmando a capacidade da espectroscopia de RMN para detecção de uma grande variedade de famílias de compostos, numa só corrida. Experiências de RMN bidimensionais foram realizadas para uma identificação detalhada espectral, tendo-se conseguido identificar cerca de 40 compostos, incluindo álcoois, aminoácidos, ácidos orgânicos, nucleósidos e açúcares. Numa segunda parte do Capítulo 3, a variabilidade composicional da cerveja foi estudada. Para tal, a metodologia de metabonómica foi aplicada aos dados de RMN de 1H (RMN/MVA) para avaliar a variabilidade existente entre cerveja da mesma marca, produzida no mesmo país mas diferindo nas instalações e datas de produção. Diferenças entre instalações e/ou datas de produção foram identificadas, revelando variações composicionais relacionadas com alguns passos do processo, tais como brassagem, fermentação e maturação. O Capítulo 4 descreve a quantificação de ácidos orgânicos em cerveja por métodos baseados na espectroscopia de RMN. Diferentes métodos quantitativos foram desenvolvidos e comparados, nomeadamente por integração directa dos sinais de RMN (vs. referência interna ou vs. uma referência externa electrónica, método ERETIC), e por métodos estatísticos quantitativos (usando a regressão parcial em mínimos quadrados (PLS)). Os modelos de PLS foram construídos usando como métodos quantitativos de referência a electroforese capilar com detecção directa e indirecta e ensaios enzimáticos. A comparação dos resultados obtidos pelos modelos de PLS1-RMN que demonstraram melhor poder de previsão com os resultados obtidos pelos métodos de integração directa foi realizada, estando estes últimos em concordância com os obtidos pelos modelos de PLS1, apesar de alguma sobreestimativa ter sido detectada na quantificação dos ácidos málico e pirúvico, assim como uma aparente subestimativa para o ácido cítrico. Finalmente, no Capitulo 5, desenvolveram-se estudos x metabonómicos para uma melhor compreensão do processo de envelhecimento forçado da cerveja. O processo de envelhecimento forçado (durante 18 dias, a 45 ºC) de um lote de cervejas foi acompanhado por i) RMN, ii) GC-MS e iii) MIR. Aplicando os métodos de MVA a cada um dos conjuntos de dados, observou-se uma clara separação entre dias de envelhecimento para os dados de RMN e de GC-MS, com a identificação de compostos significativamente relacionados com o processo de envelhecimento, nomeadamente 5-hidroximetilfurfural (5-HMF), ácidos orgânicos, ácido γ-amino butírico (GABA), prolina, e a razão de dextrinas lineares/ramificadas (por RMN) e 5-HMF, furfural, succinato de dietilo e fenilacetaldeído (marcadores do envelhecimento da cerveja) e, pela primeira vez, 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4(H)-piran-4-ona (DDMP) e maltoxazina (por GC-MS). Para os dados de MIR, nenhuma tendência de envelhecimento foi identificada nos moldes experimentais investigados. A correlação entre os dados de RMN e GC-MS foi também realizada através dos métodos estatísticos de análise do produto externo (OPA) e por correlação espectral interdomínios (statistical heterospectroscopy-SHY), permitindo a identificação de um maior número de compostos (11 compostos, 5 dos quais ainda não estão atribuídos) relacionados directamente com o envelhecimento, originando uma descrição mais completa das variações composicionais que ocorrem durante o processo de envelhecimento. A correlação entre dados sensoriais e os dados analíticos obtidos por RMN e GC-MS também foi avaliada, usando para tal, modelos de regressão de PLS tendo os dados sensoriais como referência, Os resultados obtidos demonstram uma relação entre os dados analíticos e os sensoriais, especialmente para a região aromática do espectro de RMN e para os dados obtidos por GC-MS (r > 0.89). Contudo, o poder de previsão de todos os modelos de PLS1 construídos foi relativamente baixo, reflectindo o reduzido número de amostras/provadores utilizados neste estudo