细胞周期差异表达cDNA A54-3的克隆及在胃癌中表达水平的变化

该实验室前期工作分离到38条在BGC823细胞G1期和S期差异表达的cDNA片断,其中一条G1期高表达的cDNA片段A54-3属于Unigene Hs.19322,我们通过Northern blot确定了A54-3的mRNA全长约为4.5kb,目前该片段已知最长mRNA为3651 bp,因此判定该cDNA片段A54-3属于一个未被完全克隆的新基因,我们命名为A54-3.对A54-3进一步生物信息学的分析,通过查询NCBI数据库和应用多个生物软件分析了其核苷酸序列及蛋白质序列,确定了基因的结构、染色体定位、表达特征,并预测了基因的功能及蛋白质的结构域.分析结果表明A54-3定位在染色体9q34.3,包括6个外显子,5个内含子.GOA提供的预测结果表明,A54-3蛋白定位在细胞核,结合DNA调控基因转录,而且NCBI在线分析表明蛋白质中有多个磷酸化位点.这些分析结果对以后的实验工作具有重要的指导作用.通过对Unigene重叠群的分析,发现大部分EST来源于肿瘤细胞系和肿瘤组织.Digital Northern分析显示,在前列腺癌中呈高水平表达,而在乳腺癌,大肠腺癌,卵巢癌,脑胶质细胞瘤,脑室管膜母细胞瘤,肾胚胎组织亦有表达.依据Unigene Hs.19322中的一条mRNA(gi14495653)序列,设计引物.利用RT-PCR技术首先检测其在肿瘤细胞系中的表达情况.在此基础上我们采用半定量RT-PCR和mRNA原位杂交检测了不同组织中A54-3的表达,确定它在肿瘤组织中高表达,在正常组织不表达.RT-PCR证实胃癌配对组织中,A54-3在癌组织表达而正常组织不表达.在包含100个胃癌组织和20个正常胃组织的微阵列片上,进行原位杂交,结果证明了胃癌组织A54-3表达阳性率为53％(53/100),而正常的胃组织不表达.组织阵列中mRNA原位杂交证实,A54-3在63％的乳腺癌和53.8％的宫颈癌表达阳性,而正常组织不表达.为了明确A54-3基因的功能,最终需要在蛋白质水平验证表达差异,并找到与之相互作用的其它分子,因此,需要制备抗体.我们同时采用了两个方案,其一,扩增CDS用于表达蛋白质,但是工作中发现此基因的GC(78％)含量很高,扩增全长CDS有一定的困难,因此我们设计了扩增CDS片断的引物,得到了2个CDS的小片断,计划进行原核表达,然后制备多克隆抗体;其二,依据DANSTAR分析结果和已有经验,直接合成3个多肽,免疫动物,制备多克隆抗体.为后续工作奠定了基础.