Estudo das reacções celulares no músculo esquelético em condições de hipogravidade simulada no modelo animal

Doutoramento em BioquímicaO presente trabalho teve como objectivos principais, em animais suspensos pela cauda: (i) estudar a resposta atrófica do músculo esquelético durante uma semana de hipogravidade simulada; (ii) avaliar as manifestações bioquímicas e estruturais de morte celular e de proteólise nos músculos atróficos; (iii) estudar a contribuição temporal destes mecanismos durante uma semana de suspensão do animal; (iv) analisar a influência do padrão fenotípico muscular na resposta atrófica, e (v) avaliar a contribuição dos diferentes tipos de células do tecido muscular esquelético ao longo de uma semana de suspensão. Para alcançar estes objectivos, sete grupos de ratinhos Charles River CD1 machos (n=30 por cada grupo) foram considerados de acordo com o período de suspensão do animal: 0 (grupo controlo), 6, 12, 24, 48, 72 horas e uma semana. Quarenta e oito horas antes do sacrifício, 10 animais de cada grupo foram injectados com BrdU enquanto que os restantes 20 ratinhos foram injectados com uma solução salina. Uma vez finalizado o respectivo tempo de suspensão, os músculos soleus e gastrocnemius foram removidos e tratados de acordo com os parâmetros bioquímicos (expressão de isoformas MLC, marcadores apoptóticos, autolíticos, inflamatórios, proteolíticos e de proliferação celular) e os índices morfológicos (morfometria, ultraestrutura e imunohistoquímica) a serem analisados. Os resultados confirmam o impacto negativo que a remoção de carga exerce na massa muscular e na área transversal das fibras dos músculos soleus e gastrocnemius. Nas condições experimentais estudadas observou-se, no gastrocnemius, uma progressiva expressão fenotípica característica das fibras de contracção rápida. A activação de estratégias celulares e moleculares específicas, nomeadamente dos mecanismos de morte celular e de proteólise, acompanharam estas alterações do sistema contráctil. A apoptose e a necrose parecem constituir os mecanismos subjacentes à eliminação de mionúcleos e dos seus domínios das fibras atróficas. Vários sistemas proteolíticos parecem intervir na degradação de proteínas musculares constatada nas condições experimentais estudadas, nomeadamente o sistema lisossómico, as proteases neutras activadas pelo cálcio e o sistema da ubiquitina-proteassoma. A activação destes processos celulares foi contrabalançada por uma actividade celular proliferativa (células satélite, células intersticiais endoteliais e não endoteliais) , avaliada pela incorporação de BrdU, o que sugere o envolvimento de mecanismos reguladores entre os processos anabólicos e catabólicos, na resposta atrófica. Os dados bioquímicos e morfológicos suportam a hipótese que defende o envolvimento de vários mecanismos celulares no desenvolvimento da atrofia muscular esquelética, embora com contribuições temporais distintas e dependente do fenótipo muscular. Os resultados não suportam a existência de um padrão comum de atrofia em diferentes músculos submetidos às mesmas condições de hipogravidade simulada.The main purposes of the present work were to study, in tail suspended mice: (i) the skeletal muscle atrophic response during one week of simulated hypogravity; (ii) the biochemical and structural evidences of cell death and proteolysis in atrophic muscles; (iii) the temporal contribution of these mechanisms during one week; (iv) the influence of the muscular phenotypic pattern in the atrophic response, and (v) the proliferative contribution of the different cell types within skeletal muscle through one week of hindlimb suspension. To reach these objectives, seven groups of male Charles River CD1 mice (n=30 per group) were assigned attending to the hindlimb suspension period: control, 6, 12, 24, 48, 72 hours and one week. Forty-eight hours before sacrifice, 10 animals from each group were injected with BrdU while the remained 20 mice were treated with a saline solution. Immediately after the suspension period, the soleus and gastrocnemius muscles were removed and treated in order to assess biochemical parameters (myosin light chain isoforms expression, apoptotic, autolytic, inflammatory, proteolytic and proliferative markers) and morphological indices (morphometry, ultrastruture and imunohistochemistry). The results confirmed that the removing of weight bearing had a negative impact on muscle mass and on cross sectional area in both soleus and gastrocnemius muscles. Moreover, the experimental conditions produced evidence for a shift towards expression of fast myosin light chain isoforms in gastrocnemius. This so-called speeding of the contractile apparatus was accompanied by the activation of specific cellular and molecular strategies, being outstanding cell death and proteolytic mechanisms. Both apoptosis and necrosis are probably the underlying mechanisms responsible for the elimination of nuclei and its domain from atrophying fibers. Likewise, several proteolytic systems seem to contribute to the observed simulated microgravity-induced degradation of muscle proteins, namely lysosome system, calcium-activated proteases and the ubiquitin-proteasome system. The activation of these cellular events was balanced by proliferative activity (satellite cells, interstitial endothelial and non-endothelial cells), evaluated by BrdU incorporation, which strongly suggests the existence of a regulatory response between anabolic and catabolic events in unloading-induced skeletal muscle atrophy. The biochemical and morphological data were consistent with the hypothesis that several cellular mechanisms participate in the development of skeletal muscle atrophy, though with different temporal contributions and reliant on muscle phenotype. Results do not support the existence of a common pattern of atrophy in different skeletal muscles submitted to simulated hypogravity.FCTPOCI/DES/58772/200