军团菌铜泵LpCopA及大肠杆菌甲酸通道FocA蛋白的结构生物学研究

膜蛋白在生命过程中起着重要的作用。它们约占全部蛋白的30％,约占全部药物靶标的60%。然而由于其在大量制备和结晶方面的高难度,到目前为止已解析的膜蛋白结构只占所有已解析蛋白结构的1%左右。膜蛋白的结构生物学研究是蛋白质的结构与功能研究领域中非常重要和具有挑战性的工作。<br> 本论文对军团菌铜泵LpCopA和大肠杆菌甲酸通道蛋白FocA这两个膜蛋白进行了结构生物学研究。铜泵属于P型ATP酶家族,它利用水解ATP获得能量主动跨膜转运铜离子以调节细胞内铜元素平衡,然而分子水平上的铜的转运机理尚未明确。人体内铜的代谢异常将导致各种疾病。LpCopA和人的两个铜泵,ATP7A及ATP7B,分别有37%和38%的同源性,通过LpCopA的晶体结构,也可以在一定程度上了解ATP7A和ATP7B的结构特征。<br> 本工作成功解析了首个高分辨率的铜泵三维结构——3.2埃的LpCopA晶体结构,并且在结晶过程中发展出一套系统、有效的膜蛋白复脂化方法。LpCopA的晶体结构表明铜泵和其它离子泵有着相似的折叠方式,具有膜外的ANP结构域,并有相似的跨膜螺旋1-6排列方式。同时,铜泵在N端有两个特异的跨膜螺旋,其中一个螺旋在膜和胞质界面上扭曲并形成一个平台,在平台的表面有保守的天冬氨酸-甲硫氨酸对,能够把铜离子引向已知的跨膜铜结合位点。这个天冬氨酸-甲硫氨酸对被命名为预结合位点。此外根据保守性分析以及铜泵与钙泵的结构比对,Glu189附近通道被推测为铜离子的释放位点。<br> 结合P型ATP酶构象变化的结构知识,本论文提出了铜泵三步式跨膜转运铜离子的模型,即铜离子先结合到预结合位点,然后转移到跨膜结合位点,最后从释放位点离开铜泵.位于跨膜螺旋1上的Leu151/Ile152残基对可以与Cys382相互作用,破坏铜泵的高亲和力(飞摩尔量级)跨膜铜结合位点,从而帮助铜离子从蛋白内释放出来。<br> 根据LpCopA的晶体结构信息,本文对Mcnkcs症和Wilson症,这两种人体与ATP7A及ATP7B突变相关的疾病的致病机理提出了解释。<br> 本论文的第二部分描述了甲酸通道蛋白FocA的结构生物学研究结果。本工作成功地在pH9.0条件下获得了FocA蛋白晶体,并且通过在纯化、结晶等各个环节的优化,有效地改善了晶体质量,将衍射能力从没有衍射提高到2.8埃。<br> 在本研究进行过程中,另外有两个研究组提前解析发表了FocA的晶体结构。与发表的FocA晶体相比,本工作得到的是与之不同的两个晶型。分子置换法的结果显示出不同的晶体堆积方式。本工作还在pH3.6的条件下成功获得了晶体,其晶体衍射能力正在进一步优化中。