Detecção de vírus entéricos em fezes humanas e águas residuais

Mestrado em MicrobiologiaA presença de microrganismos patogénicos que provêm do esgoto e que são libertados nas águas ambientais determinam a qualidade da água e consequentemente afectam a saúde pública. A gastroenterite viral constitui uma das doenças humanas mais comuns em todo o mundo sendo transmitida feco-oralmente através do consumo e utilização de águas contaminadas com vírus entéricos como o rotavírus, norovírus e adenovírus. Por esse motivo, é epidemiologicamente relevante documentar a presença dos principais vírus entéricos em águas superficiais e fezes humanas. A detecção dos agentes etiológicos responsáveis pelas gastroenterites virais em amostras de águas, de modo a avaliar o risco da sua libertação no meio ambiente, requer a prévia concentração dos vírus presentes nas amostras. Com o advento das técnicas moleculares tornou-se possível a eficaz detecção de vírus presentes em amostras de águas e fezes. Actualmente, em amostras clínicas são geralmente utilizados testes imunocromatográficos como VIKIA® Rota-Adeno (BioMérieux) que permitem a detecção qualitativa dos vírus. Para testar a sensibilidade e especificidade do método imunológico VIKIA® Rota-Adeno utilizado na dupla detecção de rotavírus A e adenovírus em amostras de fezes de pacientes com sintomas gastrointestinais do Hospital Infante D. Pedro, em Aveiro, entre Dezembro de 2008 e Julho de 2009, 18 amostras foram analisadas recorrendo ao método imunológico VIKIA® Rota- Adeno e moleculares (PCR). A detecção de Rotavírus A usando o kit VIKIA® Rota-Adeno, revelou a sua presença em 61% das amostras, enquanto a realização de RT-PCR permitiu a sua detecção em 56% das amostras, revelando uma concordância nos resultados obtidos pelos dois métodos. Relativamente à identificação de Adenovírus, a utilização do kit imunocromatográfico permitiu a sua detecção em apenas 6% das amostras, enquanto por nested PCR foi possível detectar a sua presença em 89% das amostras analisadas, demonstrando uma diferença significativa entre a capacidade de detecção de adenovírus usando as duas metodologias. A comparação dos resultados obtidos usando ambas as abordagens indica que, quando se usou métodos moleculares o adenovírus foi o agente que ocorreu com maior frequência, enquanto que utilizando o kit imunocromatográfico o rotavírus A foi o mais frequente. A sequenciação dos produtos amplificados por PCR das amostras para as quais os resultados através do kit imunocromatográfico foram negativos, permitiu a confirmação da presença de rotavírus humano do grupo A e de adenovírus humano serotipo 41 em algumas amostras de fezes. Através destes resultados observou-se que o kit VIKIA® Rota-Adeno é um método rápido e simples de diagnóstico de infecções por rotavírus A, no entanto poderá não ser suficientemente sensível e específico para detectar adenovírus, por esse motivo a utilização de métodos moleculares como o PCR parecem ser a alternativa mais eficiente. Neste trabalho observou-se também a presença simultânea de rotavírus A e adenovírus em 50% das amostras de fezes analisadas, quando detectadas por métodos moleculares, levanta a questão se um único vírus é responsável pela doença ou se a sua etiologia é provocada pela presença dos dois vírus. Estudos passados demonstraram que rotavírus A e adenovírus são agentes causadores de gastroenterites, neste estudo observou-se esse facto. Neste trabalho analisou-se também 467 amostras de fezes de pacientes com sintomas gastrointestinais através do kit imunocromatográfico, onde foram detectadas positivamente rotavírus A em 12.6% amostras, enquanto apenas 1% das amostras foram positivas para adenovírus. De modo a avaliar a incidência de gastroenterites virais através de informações recolhidas em 474 casos, foi possível concluir que a maioria dos pacientes com sintomas gastrointestinais tinha menos de 5 anos de idade e que o menor número de casos ocorre nos meses de Verão (entre Julho e Setembro). No que diz respeito à infecção por rotavírus concluiu-se também que a maioria das infecções ocorreu em crianças com idade pré-escolar e apresenta sazonalidade nos meses de inverno (de Dezembro a Março). No que diz respeito à infecção por adenovírus só foi possível observar que a maioria dos casos também ocorre em crianças com idade pré-escolar. Para a detecção de vírus em águas residuais foram utilizados dois métodos de concentração (ultracentrifugação e floculação), tendo sido a sua eficiência de recuperação determinada por quantificação das partículas virais obtidas em cada um dos métodos por microscopia de epifluorescência. As amostras de água residual foram recolhidas em Março e Julho de 2009 na zona de tratamento secundário da ETAR Sul de Aveiro. A detecção da presença de rotavírus A e adenovírus por métodos moleculares (RT-PCR e nested PCR, respectivamente) em todas as amostras de águas analisadas, foi possível após a concentração prévia dos vírus. Com base na simplicidade, rapidez e eficácia de recuperação, a ultracentrifugação (68% de eficiência de recuperação) revelou ser o melhor método de concentração de vírus comparativamente com a floculação em que a taxa de recuperação média registada foi de 38% e o procedimento tem uma duração de pelo menos 16 horas. O facto do protocolo da ultracentrifugação ser relativamente rápido e não envolver a adição de reagentes, permite uma visão ecológica global dos vírus presentes nas amostras de água, recorrendo-se posteriormente, por exemplo, a abordagens metagenómicas ou de pirosequenciação. No entanto na floculação é adicionado leite desnatado, HCl e NaOH à amostra podendo afectar a comunidade viral.Wastewater-borne pathogenic microorganisms that are released into the environmental waters affect water quality, and consequently human health. Viral gastroenteritis is one of the most common human illnesses worldwide, contracted by human consumption and use of polluted waters contaminated with enteric virus, namely rotavirus, norovirus and adenovirus. Therefore, it is epidemiological relevant to document the presence of etiological agents of these diseases in environmental waters and human faeces. In order to evaluate the risk of sewage discharges into the environment it is necessary to detect pathogenic viruses, and for that, it is required a virus concentration from superficial waters before the detection. The advent of molecular analysis allows an effective and more sensitive detection of viruses in samples like water or faeces. In clinics are usually used immunochromatographic assays such as VIKIA® Rota-Adeno (BioMérieux) that allows qualitative virus detection. To test the efficacy of immunochromatographic kit in virus detection, between December 2008 and July 2009, 18 faecal samples of gastroenteritis symptomatic patients from Hospital Infant D. Pedro, in Aveiro, were analyzed using simultaneously the immunologic method VIKIA® Rota-Adeno and molecular methods (PCR). The presence of rotavirus A was detected in 61% using the VIKIA® Rota-Adeno kit and in 55% of the samples using RT-PCR, demonstrating a similarity in the sensitivity of both methods for rotavirus A detection. In the case of adenovirus, 6% of the samples were positive when detected by VIKIA® Rota-Adeno kit, while the nested PCR revealed a positive result in 89% of the samples, indicating a significant difference in the detection power of the two methods. Through the analysis of this results, using the immunochromatographic method, rotavirus A were the most frequent while using molecular methods the most frequent was adenovirus. The presence of the viruses in positive amplifications was confirmed by sequencing analysis indicating the presence of human rotavirus A and human adenovirus 41 in all samples that were positive through PCR. The results obtained also indicate that the VIKIA® Rota-Adeno kit is a rapid and efficient diagnosing method, however might not be sensitive enough. Consequently, PCR approach might be the best detection method, since is a higher specific method but is more time consuming. In this work it was also observed simultaneous detection of rotavirus A and adenovirus in 50% of the samples analyzed using molecular methods, raising the question of whether a single virus is responsible for the illness or wither both viruses are involved causing the disease. To evaluate the incidence of viral gastroenteritis, two of the main enteric viruses implicated in gastroenteritis were detected in faecal samples of patients with gastroenteritis symptoms. From January 2006 to July 2009 were collected 474 faecal samples of patients with gastroenteritis symptoms. Among 474 samples 467 were analyzed by VIKIA® Rota-Adeno kit and was detected rotavirus A infections in 12.6% samples while only 1% of the samples were positive for adenovirus. Through the clinical information of the 474 cases was possible to demonstrate that the majority of the patients with gastroenteritis symptoms had less than 5 years and the number of cases was lower in summer months (from July to September). Rotavirus infection also had a higher incidence in children younger than 5 years old and the peak of the cases occurred in winter months (between December and March). Relatively to adenovirus infection, was just possible to conclude that the majority of the cases occur in children with pre-scholar age. To detect viruses in residual waters two concentration methods were compared (ultracentrifugation and flocculation), using the total viral number determined by epifluorescent microscopy before and after water concentration by both concentration methods. The samples were collected in March and July 2009 at a wastewater secondary treatment in Aveiro. Rotavirus A and adenovirus were positively detected by molecular analysis (RT-PCR and nested PCR, respectively) in all residual water samples analyzed after virus concentration. The results based on simplicity, rapidity and recovery rate, the ultracentrifugation was the best method with 68% of virus recovery, while flocculation had 38% of recovery and took at least 16 hours of procedure. The rapidity of ultracentrifugation method could avoid structural changes in viral community allowing the analysis of the sample by metagenomics or pyrosequencing, giving a global ecologic view of the viruses present in water samples. In flocculation method the viral community could be more affected, since was added skimmed milk to form flakes and was added HCl and NaOH to low and high the pH