人类HSCARG蛋白结构和功能的研究

HSCARG基因(GeneID:57407)在NCBI的注释中属于“功能未知”。我们从IMAGEcDNA库克隆到相应读码框片段，并表达纯化了HSCARG重组蛋白。对重组蛋白进行晶体筛选并成功地得到了晶体，收集到2.4A的衍射数据。利用硒代甲硫氨酸的单波长反常散射法(Se-SAD法)解析出HSCARG蛋白的三维结构(PDB编号是2EXX)。在DALI数据库中比对结果表明HSCARG蛋白与NmrA蛋白的结构较为相似。HSCARG蛋白可以分为两个结构域，N-端结构域含有一个Rossmanfold，由7个平行的β-strands和9个α-helices组成α/β结构，是结合二核苷酸的典型结构；C-端结构域的二级结构比较少，包括两个β-sheets和一些α-helices。HSCARG晶体的一个不对称单位中含有两个蛋白分子，这两个蛋白分子形成了不对称二聚体，其中，分子A以19对氢键与一个NADP+分子结合，而另一个分子B则不结合NADP+分子。不对称二聚体中的两个蛋白分子存在着很大的构象差异。相对于B分子而言，A分子的结构更加紧凑而有序。在A分子和B分子差异最大的区域(Gly123-Ile143)内，A分子的Lys133与NADP+形成了2对氢键；而B分子则用这段区域中的氨基酸与A分子形成了二聚体，我们认为不对称二聚体的形成造成了HSCARG蛋白分子发生构象变化，使得蛋白由A分子构象变成B分子构象。 在晶体结构中HSCARG蛋白是以二聚体形式存在，但是在Tris缓冲液中绝大多数HSCARG蛋白却是以单体形式存在的；而在模仿晶体生长条件的部分磷酸缓冲液中，HSCARG蛋白又是以二聚体存在的，这表明HSCARG蛋白存在着单体变成二聚体的现象，磷酸缓冲液加速了二聚体的形成。对HSCARG中参与结合NADP(H)的部分氨基酸(Arg37，Tyr81)进行点突变，分析NADP(H)结合能力缺陷的HSCARG突变体的晶体结构，证实突变体蛋白以单体的形式存在，暗示了部分蛋白结合NADP(H)是二聚体形成的基础。 体外生化测定表明，NADPH和NADP+与HSCARG蛋白的解离常数分别是0.486μM和13.5μM，这说明HSCARG蛋白能感应细胞中氧化还原状态的变化，并且对细胞中的NADPH水平做出反应。在HeLa细胞中，HSCARG蛋白主要定位在细胞质和核膜周围一圈，与细胞骨架蛋白cytokeratin有共定位的现象。HSCARG突变体实验表明，R37A、Y81A和K133A突变体结合NADPH能力大大下降或者丧失，并且这三种突变体蛋白在核膜周围的定位很少或者消失，这也表明NADPH对HSCARG蛋白在细胞中的功能起着重要的作用。 通过Co-IP以及Pulldown等实验，我们实验室发现并证实了HSCARG蛋白和精氨琥珀酸合成酶(AS)能直接相互作用，这是研究HSCARG细胞功能的另一条重要线索。AS催化精氨酸合成中的限速步骤，影响着细胞中一氧化氮和尿素的合成。体内实验表明，过表达HSCARG蛋白会抑制293T细胞中一氧化氮的合成。此外，NADP(H)结合能力缺陷的HSCARG突变体与AS的相互作用增强，所以，NADPH的结合在一定程度上能抑制HSCARG与AS的结合。 许多能结合二核苷酸的蛋白具有脱氢酶或者还原酶以外的功能，这类蛋白主要在基因转录或者细胞氧化还原平衡等方面起调控作用。结构分析表明，HSCARG是NmrA/SDR结构超家族的一员，它的结构与NmrA的结构最相似，但由于它缺乏短链脱氢酶(SDR)中非常保守的Ser…TyrxxxLys催化motif.所以不具备短链脱氢酶活性。生物信息学检索表明，HSCARG基因的2个邻近基因(HMOX2和DNAJA3)都属于抗胁迫基因，而且在多种物种中，HSCARG基因都和这2个基因相邻。这两个邻近基因影响着细胞的生长、衰老和凋亡等过程。在我们实验中，过表达HSCARG蛋白能提高细胞的生长活性，而当HSCARG蛋白的表达受到干涉后，引起细胞凋亡。这些结果都表明，HSCARG和其邻近基因可能在功能上相关：HSCARG可能属于某种类型的调控因子，能感应细胞中的氧化还原状态，并且是细胞中氧还状态的维持者之一，影响细胞的生长、衰老和凋亡。