Aplicação das técnicas PCR, SSCP e sequenciação automática na análise de polimorfismos no TLR7 em lesões do colo do útero

Mestrado em Métodos BiomolecularesOs factores imunológicos do hospedeiro são muito importantes na susceptibilidade à infecção e na persistência de infecções por HPV e, consequentemente, no desenvolvimento de cancro do colo do útero. As infecções persistentes por HPV de alto risco são o principal factor de risco para o desenvolvimento de cancro do colo do útero. Embora a infecção por HPV seja necessária, não é suficiente para causar este tipo de cancro. As respostas imunológicas inata e adquirida são importantes na prevenção e regressão das lesões causadas por HPV. O sistema imunológico inato reconhece características que identificam antigénios estranhos ao organismo, através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), e inicia uma resposta apropriada. Os receptores tipo-Toll (TLR), nomeadamante os TLR7 e 9, são PRRs que podem estar envolvidos no reconhecimento de vírus. A activação de TLRs por componentes virais estimula a resposta imunológica inata através da estimulação da síntese de citoquinas, como interferons (IFNs) do tipo I, IL-1β e IL-6, que podem actuar directamente na replicação viral. Estes sinais levam também ao recrutamento de células imunológicas para os locais de infecção e à activação de células dendríticas, que desencadeiam a resposta imunológica adquirida. Alterações/ polimorfismos em genes que codificam factores imunológicos do hospedeiro como os TLRs, podem comprometer a resposta imunológica. A investigação de factores genéticos ligados à resposta imunológica poderá ser importante para a compreensão da capacidade distinta de diferentes mulheres para controlar e eliminar a infecção por HPV. O objectivo deste trabalho foi tentar determinar se alterações genéticas no TLR7 actuariam como factores de risco, ou de protecção, para infecção por HPV e/ou desenvolvimento de cancro do colo do útero. Estas alterações foram pesquisadas e analisadas utilizando técnicas biomoleculares como a PCR, o SSCP e a sequenciação automática de DNA. Foram pesquisadas alterações na região codificante, zonas de splicing e UTRs do TLR7 em amostras citológicas em que foram identificadas diferentes lesões do colo do útero: células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), lesões de baixo grau (LBG), lesões de alto grau (LAG) e carcinomas, bem como amostras de controlo. Foram identificadas catorze possíveis alterações neste gene, treze na região codificante e uma na 3’UTR. Das alterações identificadas neste estudo, cinco são alterações missense, cinco são alterações sinónimas e três são inserções com alteração da pauta de leitura (frameshift). O polimorfismo mais estudado neste trabalho, Gln11Leu, já se encontra descrito na literatura. Não foram observadas quaisquer diferenças significativas, quer no que respeita às frequências alélicas, quer genotípicas, relativamente a indivíduos com e sem infecção, ou com diferentes graus de lesão. Uma vez que este polimorfismo se encontra localizado numa região que inclui o ectodomínio do TLR7, pode ser importante para a resposta imunológica contra o HPV, já que pode comprometer a activação das células através do TLR7. Nas restantes alterações não foi possível estabelecer qualquer relação entre a infecção por HPV e o grau de lesão já que não nos foi possível determinar o genótipo de um número suficiente de amostras devido a limitações técnicas. Estas poderão ser futuramente ultrapassadas com recurso a uma série de procedimentos que são discutidos neste trabalho. ABSTRACT: The host immune factors are very important in susceptibility to infection and persistence of HPV infections and, thus, in the development of the cervical cancer. Persistent infections by high-risk HPV are the main risk factor for the development of cervical cancer. Although HPV infection is necessary, it is not sufficient to cause this type of cancer. The innate and acquired immune responses are important in the prevention and regression of lesions caused by HPV. The innate immune system recognizes foreign antigens through pattern recognition receptors (PRR) and initiates an appropriate response. Toll-like receptors (TLR), in particular TLR7 and 9, are PRRs that may be involved in virals recognition. Activation of TLRs by viral components stimulates the innate immune response by promoting the synthesis of cytokines, such as type I interferons (IFNs), IL-1β and IL-6, which can act directly on viral replication. These signals also lead to the recruitment of immune cells to the infection sites and to activation of dendritic cells, which trigger the acquired immune response. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes encoding host immune factors, such as TLRs, may compromise the immune response. The investigation of genetic factors related to the host immune response may be important for understanding the distinctive ability of different women to control and eliminate HPV infection. The aim of this study was to determine if genetic changes in TLR7 could act as risk factors for HPV infection and/or development of cervical cancer. TLR7 genetic changes were screened and analyzed using molecular techniques such as PCR, SSCP and automatic DNA sequencing. We have analysed the TLR7 coding region, splicing areas and UTRs in cytologic samples of women that harboured cervical lesions of different grades: atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), low-grade lesions (LSIL), high-grade lesions (HSIL) and carcinomas; as well as control samples. Fourteen putative genetic changes were found, thirteen of which were located in the coding region and one in the 3'UTR. Five of them were missense changes, five were synonymous changes and three were frameshift insertions. The polymorphism that was more extensively studied in this work, Gln11Leu, was already described in the literature. No significant differences were found in allelic and genotypic frequencies with regard to HPV infection and/or grade of cervical lesion. Since this polymorphism is located in a region that includes the ectodomain of the TLR7, it may be important for the immune response against HPV as it may compromise cell activation through TLR7. With regard to the other TLR7 genetic changes, it was not possible to establish any association between any of these changes and HPV infection and/or cervical cancer development, as the number of genotyped sample was too small. This was due to technical limitations. In this work we discuss a set of procedures that may be used in the future to overcome these limitations