Estudo molecular de casos de tuberculose recorrente

Mestrado em Métodos BiomolecularesA tuberculose é uma doença infecto-contagiosa, cujo agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis, que tem permanecido, até aos dias de hoje, como um sério problema mundial de saúde pública. Depois de ter sido considerada sob controlo, a tuberculose ressurgiu de uma forma bastante preocupante, na medida em que o número de casos da doença aumentou drasticamente devido à co-infecção com o Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH). Outros factores, também importantes, como o aparecimento de estirpes clínicas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos, contribuíram para o aumento da doença. A imunodeficiência causada pelo VIH e a resistência a drogas trouxeram problemas acrescidos no controlo da tuberculose. A tuberculose recorrente é frequentemente atribuída à reactivação da estirpe de M. tuberculosis responsável pelo primeiro episódio de doença. Contudo, pode também resultar de uma re-infecção com outra estirpe de M. tuberculosis ou de infecções mistas. A identificação da causa de recorrência pode ser feita por tipagem molecular das estirpes de M. tuberculosis isoladas a partir de amostras clínicas seriadas. Os métodos de tipagem mais adequados a este fim são o RFLP por IS6110 e o MIRU-VNTR. O conhecimento da causa de recorrência é importante para o manuseamento clínico do doente. Neste trabalho, foram estudadas 39 estirpes clínicas de M. tuberculosis pertencentes a nove indivíduos com tuberculose recorrente. A totalidade das estirpes foi analisada por RFLP IS6110. As estirpes analisadas pela metodologia MIRU-VNTR obedeceram aos seguintes parâmetros (i) nos casos em que não houve alteração do perfil de tipagem por RFLP IS6110, ao longo do tempo, foi escolhida a primeira estirpe analisada de cada doente, (ii) nos casos em que se verificou alteração do perfil de RFLP IS6110 analisaram-se estirpes de cada um dos perfis obtidos. Os resultados obtidos por RFLP IS6110 permitiram concluir que apenas um doente apresenta efectiva alteração do padrão de tipagem das estirpes isoladas ao longo do tempo. Neste caso, verificou-se ganho de um elemento de inserção IS6110 pela estirpe isolada 2 anos e meio após a primeira estirpe analisada neste estudo. Outra das estirpes recuperadas deste doente apresentava uma morfologia diferente da esperada para um M. tuberculosis. Por isso, foi identificada, de novo, verificando-se ser um Mycobacterium intracellulare. As razões para este facto não foram investigadas, uma vez que este estudo incide apenas sobre estirpes de M. tuberculosis. Existe ainda outro doente em que uma das estirpes seriadas apresenta um perfil de tipagem distinto do das outras estirpes. No entanto, esta ocorrência não corresponde a uma evolução nas estirpes deste doente, visto que, a alteração surge entre estirpes com o mesmo perfil de RFLP IS6110. Assim, conclui-se que, provavelmente, ocorreu uma troca de amostras clínicas. A análise dos resultados de tipagem por RFLP IS6110 permite concluir que as estirpes dos nove doentes se organizaram em nove clusters, sendo que (i) as estirpes de dois dos doentes estudados pertencem ao mesmo cluster; (ii) as estirpes de outro doente estão divididas por dois clusters; (iii) e uma estirpe surge isolada. Os resultados obtidos da tipagem por MIRU-VNTR mostram que para um cut-of de 0.3, as estirpes se distribuem pelas famílias LAM (40%) e Haarlem (10%). As restantes estirpes (50%) não obtiveram correspondência na base de dados. A diversidade alélica para os MIRU-VNTR loci foi a seguinte: Mtub04, 0.62; ETRC, 0.58; MIRU04, -0.11; MIRU40, 0.6; MIRU10, 0.58; MIRU16, 0.6; Mtub21, 0.4; QUB11b, 0.62; ETRA, 0.24; Mtub30, 0.58; MIRU26, 0.62; MIRU31, -0.11; Mtub39, 0.62; QUB26, 0.73; QUB4156, 0.24. Este trabalho permitiu-nos concluir que a tuberculose recorrente nos nove doentes estudados se deve à persistência da estirpe de M. tuberculosis inicial, ou por reactivação quando existe mais do que um episódio de doença, ou por resistência aos fármacos usados no tratamento. Esta última causa é de todo a mais importante, já que todas as estirpes analisadas são resistentes à maioria dos fármacos de 1ª e 2ª linha. ABSTRACT: Tuberculosis is an infectious disease, caused by the etiological agent Mycobacterium tuberculosis, which has remained a serious global health problem until today. Having been considered under control until some 20 years ago, the number of cases of the illness drastically increased since then due to co-infection with the Human Immunodeficiency Virus (HIV). Moreover, the emergence of clinical strains of M. tuberculosis resistant to antibiotics has contributed to the increase of the disease. The immunodeficiency caused by HIV and drug resistance pose serious problems to the control of tuberculosis. Tuberculosis recurrence is frequently attributed to the reactivation of the M. tuberculosis isolate responsible for the first episode of the disease. However, this can also be due to an infection with another isolate of M. tuberculosis, or to mixed infections. The cause of recurrence can be identified by molecular typing of serial isolates of M. tuberculosis. IS6110 RFLP and MIRU-VNTR are the methods of choice for genotyping of M. tuberculosis clinical isolates. Knowledge of the cause of recurrence is important for clinical management of patients. In this work, 39 clinical isolates of M. tuberculosis belonging to nine individuals with recurrent tuberculosis were studied. All strains were analyzed by IS6110 RFLP. MIRU-VNTR was used to type (i) the first strain of each patient when serial strains showed no change in the RFLP profile throughout the time or (ii) each strain with a different IS6110 profile when there was a change in the fingerprinting pattern of the serial strains. IS6110 RFLP results showed that only one patient displayed a change in the pattern of serial isolates with gain of one IS6110 band. One of the strains isolated from this patient was identified as Mycobacterium intracellulare. The reasons for this were not investigated since this study is focused only in tubercle bacilli. Another patient has an isolate with an IS6110 RFLP profile completely different from the other isolates, which probably corresponds to a swapped sample. Analysis of the results using Bionumerics led to the conclusion that the patients included in this study are organized in nine clusters, being that (i) strains from two of the patients belong to the same cluster, (ii) strains of one patient are divided in two clusters, (iii) and a strain is isolated. Results of MIRU-VNTR were analyzed using MIRU-VNTRplus programme, which allows identification of lineages. For a cut-off of 0.3, 40% of the strains belong to the LAM family, 10% to the Haarlem family and the remaining 50% did not find a match in the database. The allelic diversity of the MIRU-VNTR loci, is: Mtub04, 0.62; ETRC, 0.58; MIRU04, -0.11; MIRU40, 0.6; MIRU10, 0.58; MIRU16, 0.6; Mtub21, 0.4; QUB11b, 0.62; ETRA, 0.24; Mtub30, 0.58; MIRU26, 0.62; MIRU31, -0.11; Mtub39, 0.62; QUB26, 0.73; QUB4156, 0.24. This work showed that the cause of recurrent tuberculosis in the nine patients studied is due to persistence of the initial strain of M. tuberculosis, to reactivation when there is more than an episode of disease, or to antibiotic resistance. The latter cause is the most important of all, since all the analyzed strains are resistant to the majority of the 1st and 2nd line drugs