人类氯离子细胞内通道蛋白(CLIC2)晶体结构与功能研究

人类氯离子细胞内通道蛋白(humanchlorideintracellularchannelproteins，CLICs)是上世纪九十年代发现的新型阴离子通道。该家族包括六个成员，依次命名为CLICI-6。他们彼此之间在一级序列有40％至80％的同源性，其特征是具有一个240个氨基酸残基左右保守的核心结构域。CLICs具有广泛的组织和细胞分布，定位在各种生物膜，如细胞膜、核膜、溶酶体膜、线粒体膜、高尔基体膜、细胞连接处等。CLICs的特性是既可以与生物膜结合形成离子通道，也可以在水溶液状态下具有稳定结构。在水溶液状态下，CLICs在三维结构上采取了经典的谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase，GST)结构域。CLICs除具有氯离子通道活性外，还可与多种蛋白质相互作用并调节其活性，从而在细胞分裂、细胞凋亡、肾功能、骨吸收等过程中发挥重要作用。其中CLIC2是CLICs家族中研究较少的蛋白，目前仅知道CLIC2具有调节ryanodinereceptor(RyR)活性的能力，但其调节机理并不明确。本论文克隆、表达、纯化了CLIC2蛋白，并且依据CLIC2受到氧化还原调节的特性，首次运用化学试剂5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(5，5’-Dithio-bis(2-Nitrobenzoicaicd)，DTNB)处理CLIC2，得到可用于X射线衍射分析的晶体，继而解析CLIC2晶体结构。解析的CLIC2晶体结构表明，CLIC2整体结构与CLICl和CLIC4类似，具有谷胱甘肽转移酶结构。该结构由N端硫氧还蛋白结构域和C端全α螺旋结构域构成，在两结构域之间有一个带正电的缝隙。在CLIC2的N端结构域中，两结构域之间的缝隙附近，第30位半胱氨酸与第33位半胱氨酸形成了分子内的二硫键。这是CLICs家族蛋白首次在活性位点附近发现的二硫键。该二硫键与谷氧还蛋白晶体结构中活性位点的分子内二硫键十分相似。并且由于在晶体结构中，一个CLIC2分子中带负电的footloop插入了邻近不对称单位中CLIt2带正电的结构域间缝隙(CyS30与Cys33形成的二硫键附近)。我们推断，CLIC2通过其带正电的缝隙与其靶蛋白(如RyR)中具备明显负电的区域结合，并通过CLIC2中30位和33位半胱氨酸的不同氧化还原状态调节靶蛋白活性。在CLIC2的晶体结构中，还发现CLIC2第114位半胱氨酸被DTNB修饰，从而有利于CLIC2结晶。本文还进一步测量了CLIC2的巯基转移酶活性和脱氢抗坏血酸还原酶活性，并对人类CLICI-4的脱氢抗坏血酸还原酶活性进行了系统研究，发现CLICl具备明显的脱氢抗坏血酸还原酶活性，这为探索CLIC2调节RyR活性的机理以及人类CLIC1的功能提供了有益的启发。