Aspectos da tolerância salina em Pisum sativum L.: influência da nutrição azotada

Doutoramento em BiologiaOs habitats salinos são caracterizados pela presença de quantidades de sais solúveis que são prejudiciais ao desenvolvimento da maioria das plantas. Cerca de 7% da superfície total de terra contém solos afectados pela salinidade. A tolerância salina das plantas baseia-se na manutenção de baixas concentrações citoplasmáticas, uma vez que o seu metabolismo é afectado pela presença de iões de Na+ e Cl- em excesso. Os mecanismos que as plantas utilizam para manterem as concentrações iónicas baixas no citoplasma são diversos. Existe consenso sobre quais as características fisiológicas a abordar para a obtenção de maior tolerância salina, o transporte iónico e a sua compartimentação, a síntese de solutos compatíveis, a protecção dos efeitos nocivos induzidos por condições oxidativas e os processos metabólicos considerados mais sensíveis, são frequentemente referidos A maioria das leguminosas é bastante sensível ao sal, tendência que aumenta se estiverem dependentes da fixação simbiótica de azoto atmosférico. É , geralmente, aceite que o estabelecimento e a fixação de N2 são os processos mais afectados pela salinidade. A maioria das tentativas de aumentar a tolerância salina em leguminosas não resultaram em variedades com uma tolerância salina demarcada, talvez porque os mecanismos subjacentes à tolerância salina ainda não estejam completamente compreendidos. A idealização deste trabalho teve como principais preocupações a constatação da existência de variabilidade genotípica na tolerância à salinidade em Pisum sativum e a avaliação da vulnerabilidade salina da simbiose (capítulo II); a obtenção e a selecção de genótipos de Rhizobium que sejam capazes de estabelecer uma simbiose efectiva sob condições salinas (capítulo III); a percepção da influência da nutrição azotada na tolerância salina de Pisum sativum ao longo do seu desenvolvimento, bem como a identificação dos mecanismos subjacentes a essa tolerância (capítulo IV); e a análise dos efeitos da salinidade e da nutrição azotada na composição proteica da semente (capítulo V). A avaliação da tolerância salina de quatro cultivares de Pisum sativum (‘Resal’, ‘Tristar’, ‘Combi’ e ‘Rauel’) evidenciou diferenças entre elas. ‘Resal’ aparece como a cultivar mais indicada para o cultivo sob condições salinas. A presença de 90 mM NaCl não afectou significativamente o seu crescimento vegetativo. No entanto, 90 mM NaCl provocou uma redução elevada no número de nódulos. Com o int uito de aumentar a obtenção de azoto simbioticamente fixado sob condições salinas, procedeu-se ao isolamento e à selecção de Rhizobium em diversos locais. Os isolados de S. Bernardo, Costa Nova e Vagos evidenciaram sensibilidade salina, uma vez que o crescimento in vitro a 100 mM NaCl provocou inibições de crescimento superiores a 70 %. Apenas os isolados provenientes de um local que durante parte do ano está sujeito a “stress” hídrico (Elvas) evidenciaram tolerância ao sal. Em alguns isolados de Elvas, o crescimento diminui menos de 30% em meio suplementado com 700 mM NaCl em comparação com o controlo,. A avaliação da eficiência de simbiose entre alguns isolados ou estirpes de Rhizobium e Pisum sativum abriu boas perspectivas para o estabelecimento de uma simbiose efectiva sob condições de salinidade moderada, devido à obtenção de três isolados que, simultaneamente, toleraram salinidades de 400 mM e propiciaram o maior crescimento da parte aérea. A forma de azoto disponibilizada influenciou o crescimento e a tolerância salina de Pisum sativum. A produtividade foi o parâmetro que melhor evidenciou essa influência. As plantas dependentes do nitrato foram as que demonstraram menor diminuição da produtividade. As diferenças de tolerância observadas só conseguem ser explicadas pela existência simultânea de mais do que um mecanismo, cujas intensidades parecem variar ao longo do tempo. À osmoregulação, conseguida parcialmente pela acumulação de Na+, Cl- e K+, associa-se a exclusão de Na+ da parte aérea. Embora a síntese proteica seja reconhecida como uma actividade celular sensível ao sódio, com excepção das plantas dependentes da fixação simbiótica de N2, a salinidade provocou o aumento do conteúdo proteico nas sementes. Facto que não será alheio à manutenção de baixas concentrações de Na + e Cl- neste órgão. Os perfis dos polipeptídicos mais abundantes não foram muito influenciados pelas condições de crescimento impostas. Contudo, a salinidade induziu o aparecimento de novos polipeptídeos que poderão conferir a este órgão maior tolerância ao aumento de níveis de Na+ e Cl- detectados nas plantas a crescer sob 90 mM NaCl. Em conclusão, este trabalho facultou o melhor conhecimento das respostas de Pisum sativum à salinidade, bem como de alguns factores que condicionam estas respostas. Os resultados permitem afirmar que, sob condições controladas, é possível o cultivo de Pisum sativum ‘Resal’ sob salinidade moderada (90 mM) sem grande diminuição de produtividade, desde que às plantas sejam fornecidos níveis adequados de azoto na forma de nitrato. Todavia, este trabalho também suscitou algumas questões: será que o estudo da tolerância salina de outras cultivares de Pisum sativum poderá dilatar o intervalo de tolerância da espécie? Será que a selecção de novos isolados de Rhizobium poderá permitir o aumento da eficiência de nodulação em Pisum sativum ? Quais os solutos orgânicos que as células de Pisum sativum acumulam de modo a ajustarem osmoticamente o citoplasma? Qual o gradiente de concentração de sódio e cloro através do tonoplasto em cada um dos órgãos da planta? Qual a resposta das plantas, sob stress salino a uma nutrição mista de azoto diatómico fixado simbioticamente e de menores níveis de nitrato?Saline habitats are those containing soluble salts concentrations that impair glicophytes growth. Nearly 10% of the total land surface is covered with different types of salt affected soils. Plants maintain low cytoplasmic sodium ion concentrations as a mean to achieve salt tolerance, once the excess of Na+ and Cl- ions affect their metabolism. Plants usually, rely on different mechanisms to maintain low cytoplasmic ion concentrations. There as been reasonable consensus on which physiological characteristics must be improved, to achieve salt tolerance. The attention is focused on ion transport and compartimentation, synthesis of compatible solutes, protection against deleterious oxidative effects, and metabolic processes that are salt sensitive. Most of legume plants are quite sensitive to salt, and this sensitivity is even grater when relying on dinitrogen fixation. Usually, nodule establishment and N2 fixation are considered the most salt sensitive phase in the symbiotic process. Most of reported attempts to enhance legume salt tolerance didn’t result in salt tolerant varieties, probably because the mechanisms that afford salt tolerance are difficult to understand. The main purposes of the present work are: the existence of genotipic difference among Pisum sativum and simbyosis salt sensitivity evaluation (chapter II); Rhizobium isolation and screening for N2 fixation efficiency under saline conditions (chapter III); nitrogen nutrition influence on Pisum sativum growth under salt stress and the mechanisms on which they rely to achieve salt tolerance (chapter IV); and salinity and nitrogen nutrition effects on seed protein composition (chapter V). The salt tolerance evaluation of four Pisum sativum cultivars resulted in significant differences among them. ‘Resal’ showed the highest tolerance with no significant vegetative growth reduction up to 90 mM NaCl in the soil. Rhizobium isolation and screening in different Portuguese locations was performed with the purpose to improve N2 fixation under salt conditions. Costa Nova, S. Bernardo and Vagos isolates showed saline sensitivity, since in vitro growth at 100 mM NaCl was reduced more than 70%. Only Rhizobium isolates from a water stressed site (Elvas), showed salt tolerance, growing under 700 mM NaCl. The symbiosis evaluation between Pisum sativum and Rhizobium isolates showed the possibility of an effective symbiosis under salt conditions. The molecular nitrogen form made available to plants influenced Pisum sativum growth and salt tolerance, and especially productivity. Nitrate dependent plants productivity was less affected by salinity. The observed salt tolerance differences can only be explained by more than one mechanism acting together, whose intensities changed during plant growth. The osmotic regulation was achieved, at least partially, by Na+, K+ and Cl- accumulation, and by Na+ shoot exclusion. Although, protein synthesis is generally considered a salt sensitive process, salinity caused increased protein seed content, exception being made by N2 fixation dependent plants. The maintenance of low seed Na+ and Cl- concentrations would account, to some extent, to this result. Protein SDS -PAGE separation revealed that growth conditions didn’t affect considerably seed polypeptides. Nevertheless, salinity induced new polypeptides which may, some how, improve seed salt tolerance. This work made possible a better knowledge of Pisum sativum responses to salinity and of factors that influenced those responses. Under mild salt conditions (90 mM NaCl) Pisum sativum ‘Resal’ can be grown without significant productivity reductions if, supplied with nitrate. But this work also raised some questions: the saline tolerance evaluation of other Pisum sativum cultivars could expand the species saline tolerance? Rhizobium isolation and screening in other sites could increase nodulation and N2 fixation efficiency under salinity? Which compatible solutes does Pisum sativum accumulate in the cytoplasm? Which is the Na+ and Cl- gradient concentration through tonoplast in each plant organ? How does plant respond to a mixed nitrate and N2 fixation nitrogen nutrition