Detecção de DNA microbiano em amostras clínicas e culturas bacterianas

Mestrado em Microbiologia MolecularAs infecções do sistema circulatório constituem um campo prioritário de intervenção, com cerca de 200000 casos de bacterémia e fungémia anualmente nos EUA, com taxas de mortalidade associadas entre 20 e 50%. Os métodos convencionais de detecção de microrganismos a partir do sangue (hemocultura) atingiram um nível de desenvolvimento difícil de melhorar. No entanto, continua a ser desejável conseguir resultados com maior sensibilidade, capazes de contornar o efeito inibitório da antibioterapia empírica muitas vezes instituída previamente à colheita, em tempo clinicamente útil. Foi testado um sistema comercial de extracção, amplificação e detecção por PCR em tempo real, SeptiFast Test, (Roche), capaz de identificar 25 espécies de bactérias e fungos directamente a partir de amostras de sangue, em cerca de 6 horas. Os resultados obtidos, quando comparados com a evidência de infecção, mostraram sensibilidade semelhante à da hemocultura (67 e 68% respectivamente) e igual valor preditivo negativo (88%), no entanto o VPN do SeptiFast é limitado aos 25 microrganismos contemplados no teste molecular. A aplicação prática do teste beneficiaria da automatização do protocolo de extracção de ácidos nucleicos, sendo importante a selecção criteriosa dos pacientes testados de forma a que este seja mais vantajoso numa relação custo-benefício. O sistema SeptiFast representa um método complementar aos métodos convencionais, podendo em fornecer informação importante em tempo clinicamente útil. No que respeita à identificação de agentes bacterianos isolados em cultura, por vezes surgem dificuldades em chegar a uma identificação conclusiva pelos métodos fenotípicos convencionais. Foi implementada uma metodologia de sequenciação automática directa, usando o sistema MicroSeq 500 Bacterial Identification Kit (Applied Biosystems). Durante um ano foram estudadas 54 estirpes com perfis de identificação ambíguos pelos métodos tradicionais. Os resultados obtidos por sequenciação foram compatíveis com a suspeita clínica, ou confirmados pelos resultados do programa de controlo de qualidade externo NEQAS. A identificação por sequenciação tornou-se uma ferramenta importante no apoio à identificação bacteriana, particularmente em bacilos gram positivo, bacilos gram negativo fastidiosos, Streptococcus do grupo viridans e bactérias anaeróbias, organismos de identificação fenotípica problemática.Bloodstream infections remain a priority, with about 200000 cases of bacteremia and fungemia annually in the USA., with mortality rates between 20 and 50%. Blood culture systems have reached such development, that further improvements will be difficult. Molecular methods offer the possibility of higher sensitivity in turnaround time, overcoming the inhibitory effect of the empirical therapy often instituted prior to sample collection. A commercial system for microbial extraction, amplification and detention by real time PCR - SeptiFast Test, (Roche) was tested. This system detects 25 species of bacteria and fungi directly from whole blood, in about 6 hours. Compared with evidence of infection, the test showed a sensitivity value similar to blood culture (67 and 68% respectively) and the same negative predictive value (88%), however for SeptiFast the NPV is limited to the 25 microorganisms contemplated in the test. The molecular system would benefit from an automated nucleic acid extraction method, being of utmost importance the criteria for patient selection in order to improve the cost-benefit relation. SeptiFast Test seems to be a complementary method to conventional assays, able to provide reliable information in turnaround time. Most clinical bacterial isolates are quickly and accurately identified by conventional techniques used in the microbiology laboratory. However there are several situations in which molecular identification can significantly improve both the time to and accuracy of identification. An automatic sequencing method was implemented for bacterial identification - MicroSeq 500 Bacterial Identification Kit (Applied Biosystems). During one year, 54 isolates with ambiguous identification profiles by standard methods were studied. The sequence based identification results were compatible with clinical suspicion or with the results from an external quality control program - NEQAS. Sequence based identification became an important tool in the support of bacterial identification, particularly in gram positive bacilli, fastidious gram negative bacilli, anaerobic bacteria and viridans streptococci, microorganisms for witch phenotypic methods are presented with greater challenges