Sequenciação do gene DMD: uma mais-valia no diagnóstico das distrofinopatias

Mestrado em Biologia Molecular e CelularA distrofia muscular mais comum é a Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (DMD/BMD), globalmente designada de distrofinopatia. A DMD é caracterizada por fraqueza muscular detectada aos 3-5 anos, perda de marcha aos 10-12 anos e morte na segunda década de vida por insuficiência respiratória e cardíaca. Contrastando, a BMD, uma forma alélica e menos grave da doença,, com um aparecimento dos sintomas mais tardio e uma progressão mais lenta. Esta patologia é causada por mutações no gene DMD, que codifica a proteína Distrofina. As mutações mais frequentes do gene DMD são as delecções e duplicações de um ou vários exões, correspondendo a 2/3 dos casos, e as restantes mutações pontuais. O diagnóstico molecular de rotina desta patologia utiliza como técnicas o Southern Blot, o PCR multiplex e o multiplex ligation-probe amplification (MLPA), que permitem a detecção das delecções e duplicações nos indivíduos afectados e ainda a definição do estatuto de portadoras nos elementos das suas famílias. O objectivo deste estudo é implementar uma metodologia para pesquisa de mutações pontuais por sequenciação directa genómica do gene DMD, cobrindo as 79 regiões codificantes e as junções intrónicas flaqueadoras. Esta técnica é combinada com a análise do mRNA por RT-PCR obtido a partir de biópsia muscular. A amostra seleccionada para este estudo consistiu em 25 pacientes com diagnóstico clínico de distrofinopatia e com diagnóstico molecular negativo para delecções e duplicações. Foram detectadas 22 mutações (88% dos pacientes), incluindo 6 mutações nonsense, 9 mutações de alteração da grelha de leitura (frameshift), 6 mutações de splicing e uma delecção de um codão. Destas alterações, 11 não se encontravam previamente descritas na literatura ou na base de dados específica do locus DMD. Esta abordagem vai permitir uma caracterização molecular precisa e diferencial dos pacientes, permitindo a sua inclusão como possíveis candidatos às terapias genicas actualmente em investigação. Para além disso, e de uma forma mais imediata, permite fornecer um aconselhamento genético e um diagnostico pré-natal mais preciso às suas famílias.The most common muscular dystrophy is the Duchenne and Becker Muscular Dystrophy (DMD/BMD), named also as dystrophinopathies. DMD is characterized by progressive muscular wasting the age of 3-5, wheelchair bondage at the age of 10-12 and death in their twenties as a result of respiratory and cardiac insufficiency. By contrast, BMD is a milder allelic form with a later onset and slower progression. This disease is caused by mutations in the DMD gene that encodes for Dystrophin. Deletions and duplications of one or more exons are the most frequent DMD gene defects associated with the disease (about 2/3 DMD/B patients), with more subtle mutations account for the remaining cases. The standard diagnostic approach using Southern blotting, multiplex PCR and multiplex ligation-probe amplification (MLPA), enables the detection of deletions and duplications, as well the ascertainment of carrier status in their families. The goal of this study is to implement a point mutation screening methodology by direct genomic sequencing of the DMD gene, covering all 79 coding regions and flanking intronic junctions. This technique is combined with mRNA analysis by RT-PCR of samples obtained from muscle biopsies. The sample selected for this analysis consisted of 25 patients with compatible clinical features and previously found to be negative for either deletions or duplications. We were able to identify 22 point mutations (88% of patients) that included 6 nonsense, 9 frameshift, 6 splicing mutations and 1 codon deletion. Of these, 11 have not been reported in the literature or in the DMD locus specific database. This approach will lead to a differential and precise molecular characterization of the patients, enabling them to be included as candidates for the gene therapies that are currently running. An immediate benefit from this work relates to accurate genetic counselling and prenatal diagnosis to patients families