Prokaryotic expression and purification of human GST-Cdc25C fusion protein and preliminary detection of its function

目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测.方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用.结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致；在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot 检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用.结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础.卫生部医药卫生科技发展基金; 国家自然科学基金; 国家自然科学基金; 高等学校博士学科点新教师专项科研基金中文核心期刊要目总览(PKU)中国科技核心期刊(ISTIC)中国科学引文数据库(CSCD)03251-2542