Comparison of Southern blotting and Real-time PCR in measuring telomere shortening

目的:分析并比较测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法在细胞衰老实际研究中的性能.方法:从不同代数(population doublings,PDs)的正常人成纤维细胞(2BS)中提取基因组DNA作为测试样本；对测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法进行优化,以点杂交的方式分析地高辛配基标记检测系统的特异性和灵敏度；分别用两种方法反复测定同一样本的平行样或不同样本并分析比较两种方法测量端粒的分辨率和精确度.结果:实际测量端粒时,地高辛配基标记检测系统虽可检测出小于1 μg的基因组DNA,但最优样本量为4～5 μg；DNA印迹法的分辨率约为150 bp,实时定量PCR法的分辨率约为300～400 bp,前者可分辨代龄相差少至2 PDs的2BS细胞端粒长度的差异,而后者只能分辨代龄相差5 PDs以上的端粒差异；实时定量PCR法重复测量误差超过10％,远大于DNA印迹法的2.5％ (P ＜0.001).结论:地高辛配基标记的DNA印迹检测系统完全适用于测量端粒长度,且性能优于实时定量PCR法,但后者方便快捷,可高通量处理样本,所以在细胞衰老研究中,应根据具体情况合理选择相应方法.国家重点基础研究发展计划; 国家自然科学基金中文核心期刊要目总览(PKU)中国科技核心期刊(ISTIC)中国科学引文数据库(CSCD)02297-3024