Establishment and application of a novel PCR assay for amplifying the full-length reverse transcriptase gene region of genotypes A～D of hepatitis B virus

目的 建立适用于扩增我国常见的乙型肝炎病毒(HBV)A～D基因型全长逆转录酶(RT)区(包含全长HBsAg编码区)的聚合酶链反应(PCR)法,并确定其在分析临床标本中的应用价值.方法 建立我国HBV基因序列库,设计适用于扩增A～D基因型HBV全长RT区引物,以A～D基因型HBV重组质粒为模板建立半巢式PCR(snPCR)法,并确定该法灵敏度.用所建立的snPCR对44份HBV DNA定量阳性(>5.0×102 拷贝/ml)慢性乙型肝炎患者血清标本进行扩增及PCR产物直接测序.结果 琼脂糖凝胶电泳及测序证实,snPCR可扩增A～D基因型HBV全长RT区,对A、B、C和D基因型HBV质粒扩增的灵敏度分别为1.2×103、7.0×102、6.0×102和6.0×102 拷贝/ml.snPCR检测HBV DNA >5×102 拷贝/ml血清标本的阳性率为88.64% (39/44),扩增阴性血清标本HBV DNA滴度均处于103 拷贝/ml水平.扩增目的 产物经直接测序确证无误.生物信息学分析显示,样品中B和C基因型分别占35.90%(14/39)和64.10%(25/39);其中15.38%(6/39)发生RT区变异,包括4例为已知耐药变异;7例(17.95%)存在HBsAg编码区变异,其中2例为已知免疫逃逸变异;6例(15.38%)发生RT区和HBsAg编码区"镜像改变".结论 建立了一种新的扩增全长RT区(涵盖全长HBsAg编码区)的snPCR.该法结合直接测序法,可同时分析我国HBV A～D基因型已知和潜在的耐药变异位点.国家重点基础研究发展计划(973计划)中国科技核心期刊(ISTIC)05379-3831