Cloning of human uPA gene and preparation of its monoclonal antibodies as well as daemon of uPA expression in breast cancer

目的 克隆人尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator,uPA)基因,制备和鉴定针对人uPA的单克隆抗体,检测uPA在乳腺癌中的表达.方法 利用RT-PcR方法从人乳腺癌细胞MDA231总RNA中扩增克隆uPA基因,构建可表达mPA蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达GST-His-uPA融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(sP2/0)融合及次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养,并进行三次亚克隆筛选出单克隆细胞株,制备腹水,纯化单克隆抗体.用Western blot、免疫组织化学等方法检测了uPA在乳腺癌中的表达.结果 克隆了1 227 bp的uPA基因片段,构建了可表达uPA蛋白的原核表达质粒pET-41b-uPA;获得了3株能稳定分泌针对uPA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG2a,它们均能特异识别uPA,与其它蛋白无交叉反应.Western blot结果显示,该抗uPA单抗与GST-His-uPA融合蛋白及细胞中的天然uPA蛋白均能结合.免疫组织化学显示,该单抗在乳腺癌低侵袭低转移细胞系MCF7中呈阴性表达,而在乳腺癌高侵袭高转移细胞系MDA231中呈阳性表达,并且能与乳腺癌组织结合,呈强阳性反应.结论 克隆了人uPA基因,通过原核表达体系制备并纯化了针对mPA的单克隆抗体,初步检测了uPA在乳腺癌细胞和组织中的表达,为深入研究uPA的功能和检测临床肿瘤组织及体液中的mPA奠定了可靠的基础.国家高技术研究发展计划(863计划)中文核心期刊要目总览(PKU)中国科技核心期刊(ISTIC)017-111