Etude de la voie de biosynthèse de la galanthamine chez Leucojum aestivum L. : criblage phytochimique de quelques amaryllidaceae

Galanthamine is an Amaryllidaceae alkaloid used worldwide for the symptomatic treatment of Alzheimer's disease because of his capacity to inhibit the acetylcholinesterase enzyme. There are two galanthamine sources for medical applications. One is the total synthesis, a complicated process because galanthamine has three asymmetric carbons, requiring stereochemically controlled synthesis. Galanthamine is also extracted from bulbs of some Amaryllidaceae such as Leucojum aestivum, Galanthus nivalis, and Narcissus sp.. The first aim of this work is to improve the accumulation of this alkaloid using biotechnologies. The second aim consists on the phytochemical screening (HPLC, LCMS, GCMS, et HPTLCMS) of in vivo and in vitro Amaryllidaceae bulbs, in order to identify new alkaloids with important pharmacological activities. Finally, the third aim concerns the study of the biosynthesis pathway in order to establish a biomimetic synthesis of galanthamine. Therefore, we established in vitro cultures of three Amaryllidaceae species. The variation of exogenousparameters led to the obtainment of high galanthamine accumulation (0.02 to 0.2 % DW). The phytochemical screening showed new alkaloids in extracts of in vitro cultures, which did not exist in in vivo extracts, and possessing high acetylcholinesterase activity (40 to 80 % Inh). The 4'-O-methyl-d3-norbelladine is incorporated into three different groups of Amaryllidaceae alkaloids. The addition of the labelled precursor to shoot cultures stimulated the synthesis of native galanthamine (0.15 % DW and 0.16 % Culture medium).La galanthamine est un alcaloïde isoquinoléique, utilisé dans le monde entier pour le traitement palliatif de la maladie d'Alzheimer en raison de son pouvoir inhibiteur de l'acétylcholinestérase. Cet alcaloïde est extrait à partir de bulbes d'Amaryllidaceae, Leucojum aestivum, Galanthus nivalis, et Narcissus sp. ou obtenu par synthèse chimique. La difficulté principale de cette dernière réside dans le respect de la configuration des centres d'asymétrie. La culture de tissus in vitro pourrait constituer une alternative intéressante pour obtenir ce composé à haute valeur ajoutée. Le premier objectif de ce projet, vise à améliorer l'accumulation de cet alcaloïde par les biais des biotechnologies. Le second objectif est de rechercher par criblage phytochimique (HPLC, LCMS, GCMS, et HPTLC-MS) de bulbes in vitro et in vivo d'Amaryllidaceae, de nouveaux alcaloïdes biologiquement actifs. Le troisième objectif porte sur l'étude de la voie de biosynthèse en vue de réaliser une synthèse biomimétique de la galanthamine. Nous avons établi des cultures in vitro de 3 espèces d'Amaryllidaceae. La variation des paramètres exogènes a conduit à une accumulation accrue d'alcaloïdes (0,02 à 0,2 % MS). Le criblage phytochimique a conduit à l'identification d'alcaloïdes nouveaux issus des cultures in vitro, n'existant pas in vivo, et présentant un puissant pouvoir inhibiteur de l'acétylcholinestérase (40 à 80 % Inh). L'ajout, de la 4'-Ométhyl-d3-norbelladine aux cultures in vitro a conduit à sa métabolisation en trois types d'alcaloïdes deutérés. Une stimulation de la synthèse et du relargage de la galanthamine native (0,15 % MS et 0,16 % Milieu) a été observée en présence du précurseur deutéré