Développement d'un biocapteur bactérien pour la détection de métaux lourds

By screening a library of lacZ transcriptional gene fusions in Escherichia coli on HgCl2, a gene whose expression was found to be mercury-inducible was isolated. This gene, named zntA, encodes a metal translocating P-type ATPbase conferring resistance of E. coli to cadmium, lead and zinc by extrusion. By measuring zntA::lacZ gene expression, we have shown that this fusion is responsive to the presence of inorganic compounds of cadmium, mercury, lead ans zinc in a dose-dependant manner. A zntA-based reporter plasmid has been constructed by insertion of the PCR synthesized promotor sequence of zntA into the plasmid vector containing luxCDABE genes encoding bacterial luciferase of Vibrio fischeri.The resulting plasmid, pZNT::lux, conferred light production to different E. coli strains upon exposure to heavy metals. The obtained reporter strain was used to develop a whole cell biosensor system for the detection of heavy metals by measuring light emission. The test conditions have been optimized by the modification of parameters such as culture medium, bacterial growth phase, cell density and pH, and the resulting protocol allowed the rapid detection of cadmium, mercury, lead and zinc from thresholds of 0,01 µM, 0,1µM, and 0,3 µM repectively. The main interest of this analytical tool is the evaluation of bioavailable heavy metal content in an environmental sample. Preliminary probing for the bioavailable heavy metals in complex matrixes such as soils and their leachates was successful. Though various environmental factors may influence the luminescence response, and the presence of different heavy metals may not be distinguished, this technique presents an interesting analytical tool for a semi-quantitative measure of heavy metals in environmental samplesA l'issue du criblage d'une banque de fusions transcriptionelles avec le gène lacZ d'Escherichia coli, un gène dont l'expression est induite par la présence de mercure a été isolé. Ce gène, nommé zntA, code pour une ATPbase de type P, qui transporte de métaux lourds (cadmium, plomb zinc) vers l'extérieur de la cellule, et constitue donc un système de résistance vis à vis de ces composés. Nous avons pu observer que l'expression de la fusion zntA::lacZ est induite en présence de composés inorganiques de cadmium, de mercure, de plomb et de zinc, et que cette réponse est dose-dépendante. Afin de créer une souche rapporteur luminescente, le promoteur de zntA a été amplifié par PCR et cloné dans le plasmide pUCD615, en amont des gènes rapporteurs luxCDABE de Vibrio fischeri. Le plasmide résultant, pZNT::lux, confère la production de lumière à différentes souches d'E. Coli, lorsque les cellules sont exposées aux métaux lourds. A l'aide de la souche rapporteur obtenue, nous avons développé un procédé de mesure luminométrique permettant la détection de métaux lourds. Les conditions de mesure ont été optimisées en modifications de paramètres tels que le milieu de culture, la phase de culture bactérienne, la densité cellulaire et le pH afin d'obtenir un protocole de mesure rapide et sensible. Le bioessai permet la détection de cadmium, de mercure, de plomb et de zinc à partir de concentrations respectives de 0,01 µM, 0,1µM, et 0,3 µM. L'intérêt principal de l'approche est qu'elle permet d'évaluer la fraction biodisponible de métaux lourds, même dans des matrices complexes tels que des sols contaminés et leurs lixiviats. Malgré le fait que de nombreux facteurs environnementaux peuvent influencer la réponse luminescente et qu'il est difficile de distinguer les proportions relatives de différents inducteurs dans un mélange, cette technique analytique peut constituer un outil précieux pour une mesure semi-quantitative de la présence de métaux lourds dans des échantillons naturel