Regulación transcripcional y efecto metabólico de la silenciación génica de la glutamato deshidrogenasa en dorada (Sparus aurata)

[spa] Actualmente, uno de los principales objetivos en la acuicultura está dirigido a minimizar la cantidad de proteína en la dieta suministrada a los peces carnívoros en cultivo y reemplazarla, parcialmente, por carbohidratos y nutrientes más económicos de origen no marino, los cuales cubrirían las necesidades energéticas. La finalidad de estos estudios es determinar si es posible realizar una intervención biotecnológica sobre GDH para reducir parte de la proteína de la dieta que los peces destinan a fines energéticos, teniendo en cuenta que GDH desempeña un papel fundamental en el metabolismo de los aminoácidos para obtener energía y proveer sustratos gluconeogénicos. Esta intervención podría contribuir, por una parte, a reducir el coste de la producción de peces en cultivo, y por otro, a la disminución de la eutrofización de las aguas causada por el incremento en la excreción de compuestos nitrogenados procedentes de la utilización de los aminoácidos como fuente de energía. De esta manera, se intenta forzar a que estos organismos utilicen fuentes alternativas de energía, como los carbohidratos, y por lo tanto reducir la cantidad de proteínas que es necesario suministrar a los peces en cultivo. Asimismo, nos planteamos estudiar la regulación transcripcional del promotor de gen gdh, así como, analizar la distribución tisular y estudiar el control nutricional a que está sujeta la expresión de GDH. Adicionalmente, nos planteamos avanzar en el conocimiento de la función celular que desempeña GDH, así como los efectos metabólicos que podría ejercer una inhibición transitoria de la expresión del ARNm que codifica para la enzima GDH en el hígado de S. aurata utilizando la técnica de silenciación génica a través del diseño de shARNs (short-hairpin ARNs). Ensayos de retardación en gel y de transfección transitoria de células HepG2 con constructos reporteros delecionados y mutados indican que USF2 transactiva el promotor del gen gdh de S. aurata a través de la unión a la secuencia E-box localizada entre las posiciones -10 a -5 en sentido ascendente desde el inicio de la transcripción. El análisis de la expresión del ARNm hepático de GDH y USF2 disminuye significativamente en peces sometidos a ayuno prolongado con respecto a los valores observados en peces alimentados. Además, siguieron el mismo patrón de expresión después de una realimentación a corto y largo plazo. La silenciación génica de GDH en hígado de S. aurata disminuye la expresión de la actividad FBPasa-1 sin afectar a la de PFK-1, favoreciendo por lo tanto el flujo glucolítico respecto al gluconeogénico a nivel del ciclo de sustrato fructosa-6- fosfato/fructosa-1,6-bisfosfato. También promueve el aumento de la concentración de α- cetoglutarato, sustrato de GDH en su actividad reductora, así como de la actividad del complejo OGDH, clave en el control del flujo del ciclo de Krebs. Además, los niveles de glutamato y glutamina, altamente dependientes de glutamato, también descendieron en el hígado de doradas sometidas a silenciación génica de GDH. Los resultados obtenidos permiten concluir que la silenciación de la expresión de GDH en hígado de S. aurata podría ser una diana de interés para favorecer la utilización de los carbohidratos de la dieta como sustrato energético y promover así un efecto de ahorro de proteínas, que permitiría reducir los costos de producción y reducir el impacto ambiental de la acuicultura.[eng] A main goal in aquaculture is aimed at minimizing the amount of protein in the diet supplied to carnivorous fish in culture and to replace it, at least partially, with cheaper nutrients, such as carbohydrates and nutrients from non-marine sources, to cover energy needs. The purpose of these studies is to determine whether it is possible to carry out a biotechnological action on GDH expression, which play a fundamental role in amino acid catabolism and provision of gluconeogenic substrates, to facilitate reduction of dietary protein allocated for energy production and favor the use of alternative nutrients. This could contribute, on the one hand, to reduce the cost of fish production in aquaculture, and on the other hand, to decrease excretion of nitrogen compounds and contamination of local waters. We cloned and charactized transcriptional regulation of the GDH gene promoter, as well as analyzed tissue distribution and nutritional regulation of GDH expression. These studies allowed us to identify USF2 as a key transcription factor involved in control of GDH expression. Additionally, we progressed in the knowledge of the molecular function exerted by GDH by performing transient inhibition of the expression of GDH mRNA in the liver of S. aurata by means of promoting a gene silencing through the design of a specific short hairpin RNA (shRNA). GDH silencing favored glycolysis over gluconeogenesis in the piscine liver. The results obtained allowed us to conclude that silencing of the expression of GDH in the liver of S. aurata could be a biotechnological target of interest to favor the use of dietary carbohydrates to produce energy and promote a protein sparing effect, which would allow reduction of the production cost and the environmental impact of aquaculture