Analisi della variabilità strutturale e funzionale dei geni delle proteine di latte di capra

la caseina alpha s1 è senza dubbio la più investigata tra le caseine calcio-sensibili nella specie caprina. Il locus di tale caseina si caratterizza per un polimorfismo molto complesso, in quanto è il risultato della combinazione di due tipi di eterogeneità: differenze nella mobilità elettroforetica e differenze quantitative nel prodotto dei diversi alleli. Fino ad oggi sono stati individuati almeno 14 alleli associati a diversi livelli di sintesi: CSN1S1 A, B1, B2, B3, B4, C, H e L (~3,5 g/l per allele), CSN1S1 E e I (~1,1 g/l), CSN1S1 F, G e D associati a ~0,45 g/l e CSN1S1 0 responsabile del fenotipo nullo (Chianese et al., 1997, Grosclaude e Martin, 1997). Più recentemente è stato individuato un nuovo allele, CSN1S1 M, probabilmente associato ad un contenuto normale di caseina alpha s1 (Bevilacqua et al., 2000). Considerando solo gli individui omozigoti esistono, dunque, capre che producono latte con un contenuto di caseina alpha s1 che varia da circa 7 g/l a 0,0 g/l. Tali differenze, pertanto, influenzano il contenuto totale di caseina: infatti le capre CSN1S1 AA rispetto a quelle CSN1S1 FF producono un latte con un contenuto considerevolmente maggiore di tale frazione proteica (~6 g/l). La principale caratteristica del gene CSN1S1 è la sua struttura estremamente frazionata. In particolare, esso è suddiviso in 19 piccoli esoni (di cui 16 codificanti per la proteina propriamente detta) di grandezza compresa tra 24 e 154 bp che si estendono su un'unità di trascrizione di circa 17 Kb (Leroux et al., 1992). A tutt’oggi sono stati individuati gli eventi mutazionali responsabili dei diversi alleli: in particolare, gli alleli A, B1, B2, B3, B4, C, G, H, L e M si caratterizzano per singole sostituzioni nucleotidiche, l’allele F per la delezione del 23° nucleotide del 9° esone (Leroux et al., 1992), l’allele E per l’inserzione di un segmento di DNA (LINE, 457-458 nucleotidi) avvenuta tra i nucleotidi 124 e 125 del 19° esone (Jansá Perez et al., 1994) e l’allele 0 per la delezione di un tratto di DNA di circa 8,5 kb (a partire dal nucleotide 181 del 12° introne) e comprendente gli ultimi 7 esoni del gene (Cosenza et al., 2001). Nel corso di una recente indagine di popolazione, l’analisi per mezzo di SDS-PAGE di 52 campioni individuali di latte prelevati da capre appartenenti ad una popolazione locale allevata in provincia di Napoli ha messo in evidenza 5 individui il cui latte produce un pattern elettroforetico caratterizzato dall’apparente assenza di bande relative alla caseina alpha s1. Analisi molecolari per mezzo di PCR Allele Specifica (AS-PCR, Cosenza et al., 2001) hanno permesso di evidenziare che tali individui non sono portatori dell’allele CSN1S1 0. I dati di popolazione e familiari disponibili (coppie madri/figlie) lasciano ipotizzare che tali individui siano omozigoti per un nuovo allele al locus CSN1S1 (denominato CSN1S1 N) associato ad una apparente assenza di tale frazione caseinica nel latte. alpha-lattoalbumina: la struttura primaria dell’alpha-lattoalbumina è stata individuata per la prima volta nel bovino nel corso degli anni settanta (Brew et al., 1970). Solo successivamente è stata chiarita la struttura primaria dell’omologa proteina caprina (MacGillivray et al., 1979; Shewale et al., 1984). L' alpha-lattoalbumina di capra, al pari di quella bovina, è costituita da 123 residui aminoacidici (MacGillivray et al., 1979) e diversi studi hanno mostrato che la conformazione di questa proteina è simile nelle due specie (Kronman et al., 1972a; Kronman et al., 1972b; Somers e Kronman, 1973). L'analisi della sequenza aminoacidica dell' alpha-lattoalbumina di capra ha messo in evidenza 12 differenze con la variante B e 11 con la variante A dell'alpha-lattoalbumina di bovino. L'alpha-lattoalbumina partecipa alla biosintesi del lattosio, interagendo con l'enzima UDP-galattosil transferasi e formando un enzima eterodimerico, la lattosio sintetasi (Ebner e Brodbeck, 1968). Nei bovini e caprini il gene che codifica per l'alpha-lattoalbumina è stato recentemente localizzato sul cromosoma 5 (Hayes et al., 1993). Il gene dell'alpha-lattoalbumina di capra (circa 2 kb) presenta un'organizzazione strutturale simile a quella dei geni dell'alpha-lattoalbumina di altre specie finora sequenziati: è costituito da 4 esoni di grandezza compresa tra 75 bp (esone 3) e 329 bp (esone 4) (Vilotte et al., 1991). Tale struttura, inoltre, è simile a quella dei geni che codificano per il lisozima, ciò rende ipotizzabile un'origine ancestrale comune dei due geni. Infatti, la complessa organizzazione genomica osservata nei ruminanti a livello del gene dell' alpha-lattoalbumina e del lisozima, potrebbe essere il risultato di diverse duplicazioni di un segmento cromosomico comprendente entrambi i geni, o gran parte di essi (Soulier et al., 1989). L'analisi del DNA genomico di capra ha messo in evidenza che diverse sequenze sono omologhe all'alpha-lattoalbumina, cosa già precedentemente osservata anche nella specie bovina ed ovina (Soulier et al., 1989). Dall'analisi strutturale di tali regioni è stato ipotizzato che questi segmenti corrispondono a pseudogeni dell' alpha-lattoalbumina che si sono originati da diverse duplicazioni dell'alpha-lattoalbumina stessa o di sequenze correlate ad essa prima della divergenza di queste specie (Soulier et al., 1989). Il gene dell'alpha-lattoalbumina di capra presenta il 92% di omologia con quello bovino e le maggiori differenze sono state evidenziate nelle regioni fiancheggianti il 5' dove, nella sequenza di capra sono presenti due piccole inserzioni (305-328 e 641-648). La seconda di esse si trova nella sequenza consenso cosiddetta "milk box", comune ai geni dell'alpha-lattoalbumina della maggior parte delle specie e a quelli che codificano per le caseine Ca-sensibili (Hall et al., 1984) ed è stato dimostrato che essa rappresenta il bersaglio di proteine nucleari (NF) non specifiche come l'NF1 (Lubon e Hennighausen, 1988). Il polimorfismo delle lattoproteine è stato maggiormente studiato nella specie bovina, soprattutto per via dell'importanza economica di questa specie (per una rassegna vedere Grosclaude, 1988). Mentre per tale specie sono stati individuati due alleli al locus dell’alpha-La (LAA A e LAA B) questo è risultato monomorfo nella specie caprina (Martin e Grosclaude, 1993). Recentemente, Chianese et al., (2000), mediante HPLC, hanno evidenziato, in campioni di latte prodotto da capre di razza Girgentana, tre diversi livelli quantitativi di alpha-lattoalbumina. Obiettivo della ricerca Obiettivo della ricerca è quello di individuare l’evento molecolare responsabile dell’allele CSN1S1 N ed analizzare la regione di DNA che contiene il gene dell’alpha-lattoalbumina nella specie caprina. A tal fine l’unità di ricerca procederà come segue: 1) prelievo di campioni di sangue e latte da un congruo numero di individui appartenenti a diverse razze/popolazioni caprine allevate in Italia; 2) estrazione del DNA dai leucociti; 3) estrazione dell’mRNA dalle cellule somatiche presenti nel latte. 4) sulla base delle sequenze nucleotidiche note costruire coppie di primers ed amplificare mediante PCR e RT-PCR rispettivamente i geni alpha-lattoalbumina e CSN1S1 (alleli A e N) ed i loro trascritti; 5) clonazione e sequenziamento dei cDNAs ottenuti; 6) analisi degli mRNAs per mezzo di dot blot. 7) evidenziare, mediante PCR e PCR-RFLPs (utilizzando differenti endonucleasi), eventuali polimorfismi; 8) sequenziare prodotti di PCR e RT-PCR; 9) analizzare, mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE e/o UREA-PAGE), i campioni individuali di latte; 10) correlare i polimorfismi evidenziati a livello di DNA e mRNA a differenze di tipo quali-quantitativo nell’espressione dei geni