ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DELLE SOIASAPONINE I E βg DAI SEMI DI SOIA MEDIANTE HPLC-DAD-MS

I legumi sono costituenti molto importanti nella Dieta Mediterranea, sono semi ad alto valore nutritivo (fibra, proteine, carboidrati, grassi vegetali di tipo insaturo, fosforo, ferro, calcio, vitamine del gruppo B). Di particolare importanza tra i composti di interesse nutraceutico troviamo le saponine che sono glicosidi di origine vegetale. Queste molecole hanno dimostrato di possedere diverse proprietà altamente salutari: abbassano i livelli di colesterolo e inibiscono il suo assorbimento, promuovono una azione anti-epatotossica, esplicano un’ azione anti-carcinogenica e promuovono un’azione anti-antinfettiva nei confronti del virus dell’HIV. Le lenticchie e la soia in particolare, ma anche altri legumi come piselli, fagioli e ceci, contengono un alto tenore di queste saponine, in particolare delle soiasaponine (glicosidi triterpenici) I (C48H78018) e βg (C54H84021). Il nostro obiettivo è stato quello di estrarre e purificare entrambe le soiasaponine a partire dai semi di soia. Le soiasaponine I e βg, una volta estratte e purificate dalla soia, verranno successivamente usate come standard per la quantificazione delle stesse in varie cultivar di lenticchie italiane, in particolare in quelle endemiche dell’Appennino Umbro-Marchigiano ad esempio quelle dell’altopiano di Castellucio di Norcia .Per effettuare l’isolamento di queste due sostanze bioattive dai semi di soia, sono necessari diversi step. Inizialmente vengono macinati 120 gr di soia cruda, ottenendo una farina di soia, la quale viene posta in una beuta con 1 L di EtOh aquoso al 70 %, sotto agitazione a temperatura ambiente. Dopo la fase di estrazione, si filtra e si scarta il precipitato. Il liquido poi viene successivamente evaporato mediante rotavapor ottenendo un estratto di soia. Una volta evaporato, viene effettuato il primo step di purificazione mediante cromatografia per gravità, dove 5 g di questo estratto vengono caricati in una colonna cromatografica con fase stazionaria costituita da silice C-18 (fase inversa) e fase mobile costituita da una miscela di H20/CH3CN in rapporto 70/30. Le frazioni eluite vengono raccolte in base alla presenza di soiasaponina I e βg, confermata dalla successiva analisi in TLC e HPLC-MS. Un’ ulteriore purificazione viene effettuata con HPLC SEMIPREPARATIVO accoppiato a rivelatore DAD utilizzando 206 e 292 nm come lunghezze di onda per la soiasaponina I e per la soiasaponina VI rispettivamente. Infine l’ analisi viene conclusa con la caratterizzazione e la quantificazione della soiasaponina I e VI tramite esperimenti in spettrometria di massa-massa (MS/MS) e HPLC-MS ( Fig.1 ). In queste operazioni è necessaria molta accuratezza vista la difficoltà nel reperire la soiasaponina βg, altamente instabile e termolabile. Quest’ultima, infatti, si trasforma facilmente in soiasaponina I a temperature maggiori di 25 gradi