Study of the potential therapeutic effect of the mesenchymal stem cells (MSCs) secretome on mammary cancer cells

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018As células estaminais, detentoras de características únicas, têm vindo a despertar um interesse cada vez maior na investigação científica, com um potencial biológico que as torna em alvos cada vez mais apetecíveis no desenvolvimento de terapias inovadoras. Para serem definidas como tal as células estaminais têm que obedecer a três parâmetros. O primeiro consiste na capacidade para se autorrenovarem ao longo da vida, nomeadamente através de um processo de reprodução assimétrica, originando, por um lado, uma célula indiferenciada, perpetuando assim o seu carácter estaminal, e dando origem, por outro, a uma célula que se diferenciará num tipo específico. O segundo parâmetro consiste na capacidade que estas células possuem de se diferenciar num tipo celular específico, sendo que aqui a plasticidade das mesmas está dependente do seu estadio de potência. Finalmente, a definição de estaminalidade dita que estas células deverão ser capazes de repovoar o seu tecido residente em caso de lesão. É importante realçar que estas células estão presentes em nichos em todos os tecidos, embora a sua taxa de renovação seja muito variável no prisma inter-tecidual. O potencial de diferenciação de uma célula estaminal vai afunilando com o avanço do desenvolvimento embrionário. Após a fertilização, uma célula diz-se totipotente, o estado mais basal do carácter estaminal, sendo capaz de se diferenciar em qualquer tipo celular no organismo, embrionário e extra-embrionário. Aquando da formação do blastocisto, as células adquirem um carácter pluripotente, sendo comummente designadas como células estaminais embrionárias (CEE), já sem a capacidade de originar tecidos extra-embrionários mas sendo ainda capazes de originar tecidos dos três folhetos embrionários na altura da gastrulação. Com o progresso do desenvolvimento embrionário, as células sofrem ainda outra redução no seu potencial de diferenciação, designando-se neste estado como multipotentes. Contudo, existem ainda evidências de plasticidade em algumas células estaminais adultas, nas quais se incluem as células estaminais mesenquimatosas (CEM). Estas células podem ser isoladas de vários tecidos neonatais como a placenta, o saco amniótico, sangue e cordão umbilical, e adultos como a medula óssea, o fígado e o tecido adiposo. Segundo as regras estabelecidas pela Sociedade Internacional para a Terapia Celular, as CEM têm que obedecer a três parâmetros: 1) capacidade de aderência a superfícies de plástico quando em condições normais de cultura celular; 2) expressão de antigénios específicos de superfície como CD105, CD73 e CD90, e não expressão de antigénios embrionários específicos entre os quais CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 e HLA classe II; 3) capacidade de diferenciação em adipócitos, osteoblastos e condrócitos, quando em condições de cultura apropriadas para o efeito. Em comparação com as CEE às quais são inerentes vários constrangimentos éticos derivados da manipulação de embriões humanos, bem como às células pluripotentes induzidas, que apresentam uma elevada instabilidade genética, as CEM apresentam-se muito atrativas do ponto de vista da sua utilização e aplicação, por apresentarem métodos de isolamento fáceis e não invasivos. Mais ainda, as CEM demonstram uma grande capacidade replicativa in vitro, que constitui um fator preponderante tendo em conta o elevado número de células normalmente requerido para procedimentos de terapia celular. As CEM têm suscitado um grande interesse do ponto de vista terapêutico, entre os quais ao nível da medicina regenerativa e toxicologia in vitro. Uma das principais características das CEM é a sua capacidade intrínseca de migrar para locais de inflamação, geralmente como resposta a redes de sinalização de citoquinas e/ou fatores de crescimento. Dotadas desta habilidade, as CEM chegam ao tecido/região lesada e aí promovem a regeneração tecidual quer através de mecanismos de diferenciação quer através da secreção de fatores parácrinos. Outra característica única das CEM é a sua capacidade para modular o sistema imunitário, tendo inclusivamente sido empregues na clínica ao nível, por exemplo, da “graft versus host disease”, na qual as células transplantadas promovem uma reação imune contra o organismo recipiente. As CEM, ao modularem a regulação de células do sistema imunitário (B, T, Linfócitos Natural Killer), permitem contornar este obstáculo inerente a várias doenças auto imunes. Curiosamente, grande parte dos efeitos terapêuticos inerentes às CEM advêm não da entidade celular por si só, ou de efeitos de diferenciação, mas sim dos fatores por elas produzidos, fatores parácrinos, comummente designados como secretoma, constituído por elevadas quantidades de proteína nomeadamente citocinas e fatores de crescimento. Este secretoma das CEM já foi responsável por efeitos de regeneração em vários modelos de doença, nomeadamente acidente cardiovascular, enfarte e regeneração de menisco. Representando entidades cada vez mais atrativas do ponto de vista da investigação científica, vários tipos de cultura celular têm sido desenvolvidos e otimizados ao longo dos últimos anos, na tentativa de maximizar o potencial terapêutico das CEM. Entre estes, a perspetiva de culturas tridimensionais das CEM tem vindo a crescer em interesse, apresentando mudanças na arquitetura celular que possibilitam uma maior aproximação àquele que é o ambiente que as células encontram em condições in vivo, em comparação com as culturas celulares em monocamada, tradicionais, as quais quando prolongadas estão associadas à perda de características celulares especificas. Quando cultivadas em 3D, as CEM apresentam tanto uma capacidade de diferenciação aumentada, como um secretoma mais rico, que se traduz, entre outros, num aumento das suas propriedades anti-inflamatórias, angiogénicas e de regeneração. Além do seu papel já provado em cenário de ferida e regeneração, a sua capacidade de migração para tumores faz ainda das CEM potenciais alvos terapêuticos para o cancro. Contudo, o seu papel neste âmbito tem-se pautado maioritariamente por trabalhos contraditórios, contrapondo estudos que evidenciam um papel anti-tumoral das CEM a outros que constatam precisamente o oposto, sendo este um tópico alvo de grande discussão na comunidade científica atual. Assim, o principal propósito deste trabalho foi avaliar o efeito do secretoma das CEM como possível terapêutica para o caso de cancro da mama. CEM neonatais humanas (CEMnh) isoladas a partir do cordão umbilical (UCX®; ECBio, PCT/IB08/54067) foram usadas para este propósito, visto terem já provado efeitos benéficos noutro tipo de doença ou lesão. Deste modo, o secretoma destas células foi produzido tanto em culturas tradicionais 2D, como em 3D, sob a forma de meio condicionado (CM2D/CM3D). Para a produção de meio condicionado 3D (CM3D), as CEM foram cultivadas em sistemas de cultura em suspensão agitados, e sujeitas a um período gradual de redução de soro, recorrendo a um protocolo previamente otimizado. As células cultivadas nesta condição formaram agregados cuja morfologia e diâmetro (< 250 μm) não sofreram alterações de maior ao longo de todo o protocolo, garantindo assim uma cultura viável e sem a presença de centros necróticos, da qual no fim foi recolhido o CM3D. Após a produção do CM2D/3D, o seu efeito foi avaliado, em primeira instância, na viabilidade de duas linhas celulares mamárias humanas: uma linha não tumoral (MCF10A) e uma linha tumoral invasiva (MDA-MB-231). Este efeito do CM (1x e 10x concentrado) foi avaliado isoladamente, e em combinação com o fármaco quimioterapêutico doxorrubicina (dox: 100 nM a 1000 nM), que constitui a primeira linha de terapêutica farmacológica contra o cancro da mama. No geral, para a linha não tumoral, verificou-se um efeito protetor significativo de ambos os CM contra a citotoxicidade induzida pela dox, particularmente no caso do CM2D/CM3D 10x concentrados. Mais ainda, esta proteção apresentou uma magnitude mais elevada no caso do CM3D (1.5x mais) quando comparado com o CM2D. Para a linha tumoral, nenhum efeito significativo adveio da aplicação do CM, apresentando-se apenas um ligeiro aumento de viabilidade celular no tratamento combinado do CM com a dox, em comparação com o fármaco sozinho. Em seguida, o efeito do CM2D/3D (1x e 10x), sozinho e em combinação com a dox (100 nM), foi avaliado na capacidade migratória da linha celular tumoral, através de um ensaio de ferida in vitro. Neste ensaio, os resultados apontaram para um aumento significativo da capacidade migratória das células tumorais, tanto no caso do CM2D como do CM3D, especialmente no tratamento com a concentração 10x. Por fim foi ainda avaliada a capacidade de invasão da linha celular tumoral através de um ensaio de quimiotaxia “transwell”, nas mesmas condições de tratamento empregues no ensaio de migração. Aqui, apesar de nenhum resultado obtido possuir significado estatístico, é possível observar a promoção de duas tendências opostas, consoante o tipo de tratamento empregue. Quando administrado sozinho, o CM manifestou uma ligeira tendência para promover a capacidade invasiva das células (10x para o CM2D, 1x e 10x para CM3D), enquanto que em combinação com a dox, o contrário foi observado. A dox, por si só, pareceu provocar um ligeiro decréscimo da capacidade de invasão celular, efeito esse que foi um pouco mais pronunciado no caso do tratamento combinado com o CM2D/3D (10x concentrado). Em suma, apesar dos resultados obtidos sugerirem alguns efeitos que apontam em diversas direções, evidenciou-se que o CM das CEMnh em estudo possui um papel protetor importante nas células não-tumorais contra a dox, o que constitui um aspeto importante num possível cenário de terapia combinada para cancro da mama, no âmbito de proteção dos tecidos saudáveis adjacentes ao tumor. Mais ainda, este efeito foi mais marcado no CM proveniente das culturas tridimensionais, demonstrando a importância crescente deste tipo de cultura em cenários inovadores de terapia celular. Contudo, mais estudos deverão ser feitos para clarificar a segurança no uso do CM das CEM para terapia em cancro da mama.Breast cancer remains one of the leading causes of tumour-related death in women, mainly due to the development of metastasis at distant sites from the primary tumour. In addition to the clinically heterogeneity of primary tumours, the heterogeneous metastatic pattern usually impairs the efficacy of the current treatments contributing to the poor prognosis of advanced breast cancer. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have demonstrated an inherent homing ability towards tumours that makes it an attractive novel field of research in the context of cancer therapy. However, MSCs impact in cancer is still controversial, with literature reporting both cancer promoting and inhibitory properties. Additionally, three-dimensional (3D) cell cultures have been reported as more in vivo-like, in aspects of morphology, viability and functionality, presenting also an enhanced paracrine activity with beneficial effects, for instance, in tissue regeneration. This work aimed to investigate the effect of the secretome of UCX®, a specific population of human neonatal umbilical cord matrix derived MSCs (hnMSCs), on human breast cancer. Conditioned medium from UCX® (MSCs-CM) was produced and collected from both 2D monolayer cultures (CM2D) and 3D dynamic spinner flask suspension cultures (CM3D). Cell viability/proliferation under treatment with UCX®-CM (1x and 10x concentrated) either alone or in combination with the chemotherapeutic drug Doxorubicin (Dox, 100-1000 μM) was evaluated through MTS assay in two human breast cell lines: MDA-MB-231 (malignant; invasive) and MCF10A (non-malignant epithelial cells). In MDA-MB-231 cells, a slight increase in cancer cell viability in the presence of Dox (n.s.) and CM2D or CM3D was observed; while for the MCF10A cell line both CM2D 10x (p<0.05) and CM3D (p<0.001) significantly decreased the cytotoxicity induced by Dox at 0.1 μM. Additionally, breast cancer cells’ ability to migrate was evaluated through an in vitro scratch assay when treated with CM2D/CM3D (1x and 10x), alone and in combination with Dox (0.1 μM). Herein, a significant increase in MDA-MB-231 cell capacity to migrate when treated with both CM2D and CM3D 10x (p