Insights into the transcriptional regulation of pks1 and pks15 among Mycobacterium tuberculosis complex bacteria

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018O género Mycobacterium pertence ao filo Actinobacteria, sendo o único membro da família Mycobacteriaceae e tendo mais de 170 espécies descritas. As micobactérias têm como principais características o seu elevado conteúdo em G+C (61-71%) e a propriedade de álcool-ácido resistência, atribuída à presença de ácidos micólicos na sua parede celular. As bactérias deste género podem ser agrupadas de acordo com o seu crescimento, estando no primeiro grupo incluídas as espécies de crescimento-lento, tais como Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis (Mb) e Mycobacterium leprae e, num segundo, as espécies de crescimento-rápido, maioritariamente oportunistas e não-patogénicas, como Mycobacterium smegmatis. Além desta divisão das espécies pelo seu crescimento, estas são também agrupadas segundo a sua semelhança genética, nomeadamente no complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC), composto por Mtb e por outros ecótipos que partilham, ao nível das sequências nucleotídicas do genoma, mais de 99% de semelhança. Os diferentes ecótipos são identificados de acordo com marcadores moleculares determinados, nomeadamente 14 regiões de diferença (RD’s) e seis regiões de eliminação (RvD’s). Entre os 20 marcadores moleculares, destacam-se RD9 e TbD1. A linhagem que apresenta a eliminação da RD9 inclui M. africanum, juntamente com outras espécies presentes em reservatórios animais, tais como, M. microti, M. pinnipedii, M. bovis, M. caprae, M. mungi e M. orygis. A eliminação de TbD1 carateriza um grupo de linhagens designadas de estirpes “modernas” de Mtb, enquanto os restantes membros de MTC não apresentam esta deleção. A espécie Mtb é o agente etiológico paradigmático da tuberculose (TB) humana. Ao nível mundial, a TB encontra-se no top 10 de causas de morte por infeção, acima da infeção por HIV/SIDA. Apesar de, nos últimos anos, se ter verificado uma diminuição das taxas de mortalidade e incidência, a doença mantém-se distribuída mundialmente, com principal incidência em Africa, na Ásia e na Europa oriental. A doença tem expressão, maioritariamente, pulmonar, mas 15% dos casos notificados em 2015 à Organização Mundial de Saúde (OMS) representam TB extrapulmonar. Em 2015, foram também notificados 480 mil casos de TB multirresistente (MDR-TB). A MDR-TB é prevalente em doentes previamente expostos a tratamentos anti-TB de forma irregular, favorecendo a seleção de mutantes resistentes. Mb, sendo um ecótipo adaptado a ungulados e carnívoros, é um agente zoonótico de TB em humanos, sendo que a infeção não é distinguível clinicamente da infeção causada por Mtb. Tipicamente, esta infeção ocorre por inalação de aerossóis em pessoas em contacto próximo com animais infetados ou por ingestão de leite não pasteurizado. A extensão da infeção por Mtb é dependente de dois parâmetros, a virulência da estirpe infetante e a competência da resposta imune do hospedeiro. As micobactérias patogénicas apresentam-se largamente adaptadas à sobrevivência dentro de macrófagos. Graças à inibição da fusão dos endossomas com os lisossomas, as micobactérias evadem-se dos mecanismos bactericidas que ocorrem nos lisossomas. A infiltração linfocitária e a ação concertada dos componentes do sistema imunitário no local da infeção limitam a disseminação das micobactérias numa estrutura designada granuloma. Durante a permanência dos bacilos no granuloma, estes são sujeitos a diversos fatores de stress, tais como hipoxia, escassez de nutrientes e pH acídico, que conduzem ao desenvolvendo de um estado de latência, não replicativo. O metabolismo micobacteriano é, no entanto, reativado mediante a supressão do sistema imunitário do hospedeiro. A parede celular das micobactérias é uma das suas principais características, sendo constituída por três estruturas, incluindo polissacáridos capsulares. O centro da parede celular é composto por peptidoglicano em ligação covalente com arabinogalactano que, por sua vez, está esterificado aos ácidos micólicos. Na parede estão também presentes glicolípidos, lipoglicanos e lipoproteínas. Entre os componentes específicos de Mycobacterium, estão os dimicocerosatos de ftiocerol (DIM) e os glicolípidos fenólicos (PGL), os quais têm sido associados à impermeabilidade da parede celular, à fagocitose, aos mecanismos de defesa contra os stresses oxidativo e nitrosativo e, teoricamente, à capacidade das micobactérias formarem biofilmes. A maioria dos genes responsáveis pela biossíntese de DIM e PGL estão localizados no locus DIM + PGL, nomeadamente os genes fadD26, ppsA-E, fadD28, lppX, pks15, pks1, fadD22, Rv2949c e fadD29. Entre estes, os genes pks1 e pks15 estão documentados como estando envolvidos na síntese de PGL, sendo que constituem uma única grelha de leitura aberta (pks15/1) em estirpes produtoras de PGL. Apesar de se conhecer a associação de pks15/1 a esta via biossintética, ainda não se encontra esclarecida a sua regulação transcricional. Tal como noutros procariotas, a transcrição em micobactérias é regulada pela associação de fatores σ à RNA polimerase, que assim formam uma holoenzima funcional na ativação da expressão génica. Cada fator tem afinidade para sequências promotoras específicas, regulando a expressão de genes alvo. Os 13 fatores σ descritos em micobactérias têm sido associados a diferentes condições de crescimento, nomeadamente o factor σA que assegura a expressão constitutiva de muitos genes do genoma micobacteriano, e o factor σB, associado à resposta geral ao stress. A função destes fatores tem sido estudado nos últimos anos por recurso à análise dos respetivos níveis de expressão e, mais recentemente, através de mutantes de eliminação, uma vez que o seu nível de expressão pode não representar diretamente a condição em que o fator efetivamente se associa à RNA polimerase. Neste trabalho, procurou-se esclarecer aspetos regulatórios e funcionais dos genes pks1 e pks15, que se sabe estarem envolvidos na biossíntese de PGL. Estudos prévios do nosso grupo de investigação analisaram a diversidade nucleotídica e aminoacídica destes genes, bem como a sua historia microevolutiva. Além disso, analisou-se também previamente a associação entre a formação de biofilme e o perfil dos lípidos de membrana de micobactérias patogénicas, em diferentes condições de stress nitrosativo e oxidativo, incluindo na presença de ácido ascórbico. O aumento de expressão destes genes nessas condições foi demonstrado por RT-qPCR. No entanto, uma vez que a informação disponível sobre os aspetos mecanísticos que regulam a expressão destes genes é reduzida, os objetivos do presente trabalho foram especificamente: [1] aferir se os genes pks1 e pks15 se encontram numa estrutura policistronica, através da construção de vetores de fusão transcricional e inferência da localização exata e condições de ativação do promotor; [2] estudar a função do gene pks1 através da construção de mutante de eliminação de pks1 por mutagénese mediada por fagos e por recombineering; e [3] inferir o padrão de regulação transcricional dos genes pks1 e pks15 pela análise de dados em larga escala do transcritoma (RNA-seq). A clonagem das regiões promotoras dos genes pks15, pks1, fadD22 foi inicialmente realizada no vetor pJET1.2/blunt, sendo bem-sucedida para os três alvos. Pelo contrário, a subclonagem dos mesmos alvos no vetor de fusão transcricional pSM128, replicativo em Escherichia coli e micobactérias, não foi concluída com sucesso, apesar das várias tentativas de otimização do rácio inserto:vector e das condições de ligação. Da mesma forma, a construção do mutante de eliminação do gene pks1 pelas duas abordagens independentes previstas não foi concluída. Pela metodologia de recombineering, foi possível gerar uma estirpe recombinante de Msm contendo o plasmídeo pJV53, sendo que não foi possível recuperar nenhuma estirpe contendo o substrato de troca alélica. Através da mutagénese mediada por fagos, o constrangimento encontrou-se na dimensão do DNA plasmídico que se pretendia construir para transdução, uma vez que a clonagem do substrato de troca alélica construído em cosmídeo no fagemídeo derivado do fago lambda gera uma construção que ultrapassa os 50 kb, ultrapassando também o limite máximo de extração da maioria dos sistemas comerciais e de métodos in-house, dificultando enormemente a recuperação do DNA plasmídico e a confirmação da obtenção do substrato transdutor. Para inferir a regulação transcricional dos genes em estudo, recolheu-se a informação disponível em diversas bases de dados, tais como Tuberculist, National Center for Biotechnology Information (NCBI), TB Database e MTB Network Portal. Além destes dados, a pesquisa do local de ligação do ribossoma (RBS) foi realizada através do Prokaryotic Dynamic Programming Genefinding Algorithm (PRODIGAL). A análise de sintenia foi também realizada para os genes pks1, pks15 e fadD22 através do SyntTax (Prokaryotic Synteny & Taxonomy Explorer). Para tentar definir o padrão e a mecanística da regulação transcricional, foi realizada uma análise de dados em larga escala do transcritoma, obtidos por RNA-seq, constituindo um conjunto de 27 condições experimentais (25 para Mtb e 2 para Mb) e um total de 77 replicados (60 para Mtb e 17 para Mb), para um grupo de 52 (Mtb) e 50 (Mb) genes codificando sintetases de poliquétidos, fatores σ e membros dos módulos de bicluster 0211 e 0490 definidos pelo algoritmo cMonkey (disponíveis no MTB Network Portal). A informação recolhida de bases de dados sugere que os genes pks1 e pks15 poderão formar uma unidade transcricional composta por 3 a 6 genes, localizados tanto a montante do gene pks15 como a jusante do gene pks1. Destes 6 genes (lppX, pks1, pks15, fadD22, Rv2949c e fadD29), apenas o gene lppX não está envolvido na síntese de fenoltiocerol. Dados anteriores baseados na análise in silico indicam que os genes pks1 e pks15 são putativamente regulados positivamente por sigK e negativamente por sigE. No presente trabalho, a análise dos dados de transcritoma indicou que, para Mtb, é possível associar num único cluster, com pelo menos 85% de semelhança, aferida pelo método de aglomeração UPGMA, os genes pks1, fadD22, Rv2949c, fadD29, pks6, pks12 e pks9. Para Mb, devido à existência de um grupo menor de dados, um cluster com o mesmo nível de semelhança inclui os genes lppX, pks15/1, fadD22, Rv2949c, fadD29 e, ainda, os genes Mb0429c e pks13. Os dados de transcritoma sugerem ainda uma associação entre os membros da estrutura policistrónica putativa e os genes que codificam para os fatores σC, σG e σK, aferida por um coeficiente de correlação de Pearson superior a 0,8. Com os dados de RNA-seq, foi também possível estabelecer uma analise de expressão diferencial que permite identificar, por comparação, em que condições os membros da estrutura policistronica putativa estão sobre e subexpressos. Dentro do lote de condições analisadas, que inclui pH acídico, fontes de carbono alternativas, diferentes fases do crescimento bacteriano, exposição a diferentes concentrações de ferro, hipoxia e latência, apenas foi verificada a sobre-expressão dos genes alvo na amostra crescida em pH acídico, quando comparada com a amostra crescida em pH neutro. A adição de piruvato como fonte de carbono alternativa ao meio de cultura não promoveu alterações significativas na expressão dos genes alvo, quando comparando com as amostras crescidas unicamente em glicerol. A comparação das amostras recolhidas em fase estacionária do crescimento com as amostras recolhidas em fase exponencial, no mesmo meio de cultura, revelaram a subexpressão dos genes alvo em fase estacionária, tal como previsto. Tanto para as amostras crescidas em alta como em baixa concentração de ferro, os genes alvo aparentam ser subexpressos por comparação com a amostra crescida em condições de crescimento padrão in vitro. Tanto para as amostras recolhidas da cultura em hipoxia, como para as amostras recolhidas da cultura em latência, os genes alvos apresentam elevada subexpressão. Para Mb, analisaram-se ainda culturas crescidas em condições de carência nutricional, revelando o mesmo padrão apresentado em Mtb para culturas em hipoxia e latência. A combinação da informação resultante da análise de clustering e da análise de expressão diferencial parece apontar para que o gene lppX, de função parcialmente desconhecida, tenha uma regulação transcricional mais divergente da dos restantes genes alvo. Confirma-se, assim, neste trabalho que os genes em estudo são regulados positivamente em pH ácido e subexpressos em fase estacionária, sob hipoxia e latência e em concentrações baixas e altas de ferro. A regulação negativa destes genes nestas últimas condições é consistente com o estado não replicativo das micobactérias no seio do hospedeiro e a subsequente redução da síntese de componentes da parede celular à medida que os processos celulares essenciais da bactéria são afetados pela resposta do sistema imunitário do hospedeiro. A análise de expressão diferencial baseada no transcritoma permitiu também confirmar que o gene sigK partilha o padrão de expressão com os genes de interesse em 80% das situações analisadas que apresentam diferenças de expressão significativas; a mesma percentagem foi também verificada para o gene sigD. Pelo contrário, em aproximadamente 78% das condições analisadas, com diferenças de expressão significativas, o gene sigE apresenta um perfil diferente do encontrado nos genes de interesse, tal como acontece com sigB. Compilando a informação recolhida das bases de dados e a informação regulatória obtida através da análise de transcritoma, propõe-se neste trabalho um modelo de regulação para os genes pks1 e pks15, tendo por base uma abordagem conservativa em que se selecionou apenas os genes com total semelhança funcional e perfil transcricional. Foram, assim, selecionados os genes pks1, pks15 e fadD22, bem como os fatores σD, σK σB e σE. Os genes que codificam os fatores σD e σK encontram-se regulados negativamente em condições de hipoxia e latência, bem como na fase estacionária, sendo que o padrão contrário é verificado para os genes que codificam os fatores σB e σE. Além dos fatores σK e σE, previamente propostos como reguladores dos genes de interesse, propõe-se também que os fatores σB e σD estejam envolvidos na regulação de pks1, pks15 e fadD22. No futuro, será da maior relevância concluir as metodologias moleculares iniciadas no presente trabalho, tais como o estudo da atividade do promotor sob diversas condições de stress que mimetizam o ambiente do hospedeiro e a construção de um mutante de eliminação do gene pks1. Estas abordagens poderão contribuir para refinar o conhecimento da regulação transcricional dos genes pks1 e pks15, clarificar aspetos mecanísticos e a forma como a transcrição destes genes é articulada com redes de expressão globais e, assim, contribuir para o esclarecimento da função biológica exercida pelo produto destes genes na parede celular das micobactérias.The Mycobacterium genus belongs to the Actinobacteria phylum, is the single member of the Mycobacteriaceae family and includes more than one hundred and seventy species. Mycobacteria are defined as acid-fast actinomycetes that usually form slightly curved or straight non-motile rods. Its acid-fastness is due to the presence of mycolic acids, an unique class of lipids that can only be found in the cell wall of species from Mycobacterium genus. This genus is also characterized by a high G+C content (61-71%). The species from Mycobacterium genus can be divided into two groups, the first includes slow-growing species like the pathogens Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis (Mb) and Mycobacterium leprae, and the second that includes fast-growing species, mostly opportunists or non-pathogens, like Mycobacterium smegmatis. Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) is constituted by Mtb alongside with other genetically related species of mycobacteria, such as Mycobacterium canettii, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mb, Mycobacterium caprae or Mycobacterium pinnipedii, each one best adapted to particular host species. Amongst the members of the MTC, Mtb is the emblematic etiological agent of human tuberculosis (TB). In 2015, TB was amongst the top 10 causes of death worldwide, even above HIV/AIDS as a leading cause of death by infection. Even though TB mortality and incidence rates are decreasing in most parts of the world, the disease remains spread worldwide, with particular incidence in Africa, Asia, and Eastern Europe. Although rare or sporadic in developed countries, infection by Mb in humans typically occurs by inhalation of aerosols in individuals in close contact with infected animals or by the ingestion of contaminated unpasteurized milk. Infection by Mb in humans is clinically indistinguishable from infection by Mtb. The clinical evolution of mycobacterial infection depends on the virulence of the infecting bacterium and on the ability of the particular host to limit bacterial replication. In an immunocompetent host, immune system cells constraint the infection in a structure called granuloma. While inside granulomas, mycobacteria experience a set of stress conditions, like hypoxia, micronutrient starvation and acidic pH, and develop a dormant, non-replicating state that can reactivate upon host immunosupression. One of the most relevant characteristics of mycobacteria is its cell wall, composed by three major structures. To the cell wall core are esterified mycolic acids, long-chain fatty acids specific of mycobacterial cell wall that are directly related to cell viability and impermeability. Amid the Mycobacterium-specific components of several pathogenic mycobacteria, namely Mtb and Mb, are two related families of glycosylated lipids: diphthioceranates (DIP) and phthiocerol dimycocerosate (PDIM) and its variant phenolic glycolipids (PGL). PGL are known to be associated with impermeability of the cell wall, phagocytosis, defense mechanisms against nitrosative and oxidative stress and, theoretically, to the ability of mycobacteria to form biofilms. The genes related to the biosynthesis of PGL belong to the class of polyketide synthases (PKS). In this work, we focused on the role of pks1 and pks15, two genes known to be involved in the biosynthesis of PGL. Previous studies from our research group have already described the nucleotide and aminoacid diversity of those genes and encoded proteins, along with their microevolutionary history, and have also assessed the association between biofilm formation and the profile of membrane lipids, in different stress conditions. Transcriptional analysis of pks1 and pks15 genes was also performed by RT-qPCR and results showed increased expression under nitrosative and oxidative stress, including in the presence of ascorbic acid. Since there is bare regulatory information for those two genes, this thesis aims were to: [1] define whether or not pks1 and pks15 are co-transcribed as polycistronic transcription units using an experimental approach targeting the construction of transcriptional fusion vectors and promoter strength inference; and [2] explain the function of pks1 through the construction of a transposon-free knock-out mutant relying on phage mediated mutagenesis and mycobacterial recombineering experimental methodologies; and [3] identify the regulatory pattern responsible for controlling pks1 and pks15 transcription using a genome-wide approach based on transcriptome data (RNA-seq) available at public databases, like Tuberculist, National Center for Biotechnology Information (NCBI),TB Database and MTB Network Portal. Cloning of putative regulatory regions was individually performed in pJET1.2/blunt for pks1, pks15 and fadD22, the minimal structure proposed for this operon, and was successful for all three targets. However, subsequent subcloning in the mycobacterial shuttle vector pSM128 was ineffective, despite several attempts. Another experimental strategy that did not work favourably was the attempt to generate a knock-out mutant of pks1, neither by phage-mediated mutagenesis or mycobacterial recombineering. We successfully made a recombineering strain with pJV53, although the attempts to electroporate the allelic exchange substrate (AES) containing the upstream and downstream regions of pks1 for homologous recombination were unsuccessful. By phage-mediated mutagenesis, we were able to generate several transductants but, due to the high dimension of the desired DNA construct (over 50 kb), we were not able to successfully confirm the ligation of the AES cloned in a cosmid with phasmidic DNA. Data collected from different databases point out that pks1 and pks15 may be transcriptional units of an operon composed by three to six genes (lppX, pks1, pks15, fadD22, Rv2949c and fadD29), all involved in the biosynthesis of the phenolptiocerol moiety of PGL with the exception of lppX. It has also been proposed, by in silico analysis, that both pks1 and pks15 are positively regulated by sigK and negatively by sigE. By clustering the transcriptome data from RNA-seq for Mtb, in a robust set of 25 growth conditions corresponding to 60 experiments from five stress datasets, in this work it was possible to relate pks1 with fadD22, Rv2949c, fadD29, pks6, pks12 and pks9, gathering evidence supporting that the first three genes are part of a polycistronic structure. Clustering analysis particularly grouped pks1, fadD22, Rv2949c and fadD29 with correlation values above 0.9, also including some of pks1 paralogs, namely pks6, pks12 and pks9. The pks1, Rv2949c, fadD22 and fadD29 genes were also highly correlated with sigC, sigG and sigK sigma factors (correlation values above 0.8). Despi