Dating evolution on island ecosystems: a case-study with the Cape Verde terrestrial biodiversity

Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2017A área da bioinformática nasceu da necessidade de desenvolver e utilizar metodologias capazes de estudar grandes volumes de dados biológicos, em particular sequências de DNA ou proteínas. Nos últimos anos diversas áreas científicas beneficiaram da introdução de ferramentas computacionais especializadas em tarefas como a análise de dados e interpretação de resultados biológicos. Na área da Biologia Evolutiva o desenvolvimento do conhecimento foi substancial desde a introdução de métodos bioinformáticos, em especial nas análises filogenéticas e datação da origem e diversificação das espécies. Atualmente é possível analisar em larga escala sequências de DNA, recorrendo a vários métodos que permitem construir filogenias informativas e bem suportadas. Particular interesse é colocado na origem da grande diversidade de espécies endémicas existentes nas ilhas oceânicas, e neste âmbito, refira-se que desde Darwin, que os ecossistemas insulares são considerados verdadeiros laboratórios naturais para estudos evolutivos. A região da Macaronésia (i.e. Açores, Madeira e Selvagens, Canárias e Cabo Verde) constitui um hotspot de Biodiversidade, dentro da bacia do Mediterrâneo, sendo que, Cabo Verde é o único arquipélago situado geograficamente numa região tropical. As 10 ilhas do arquipélago de Cabo Verde apresentam uma grande diversidade de espécies terrestres e marinhas, muito delas endémicas. De entre os principais grupos da fauna terrestre, refira-se os répteis, que dentro da Região da Macaronésia constituem a maior radiação nas ilhas de Cabo Verde. Neste arquipélago ocorrem três géneros que incluem 22 espécies endémicas (13 das quais restritas a uma única ilha), nomeadamente: i) Chioninia, que inclui as espécies de escincídeos de Cabo Verde; ii) Hemidactylus, que apresenta uma grande diversidade e distribuição por diversas partes do Mundo; e iii) Tarentola, que para além de ser encontrado no arquipélago de Cabo Verde, ocorre também nas Canárias e Selvagens, dentro da Região da Macaronésia. O elevado número de endemismos e habitats ricos com uma elevada diversidade de espécies, bem como existência de um grande número de sequências de DNA, pretendeu-se com este estudo utilizar diferentes ferramentas bioinformáticas de modo a explorar a relações evolutivas dos répteis nas ilhas de Cabo Verde. Também foram usados diferentes métodos de datação que permitiram de forma robusta e inovadora, relacionar o tempo de divergência entre diferentes espécies, contribuindo para compreender eventos evolutivos e padrões de colonização na Região da Macaronésia. A metodologia escolhida teve por base a consulta exaustiva de bases de dados públicas, como o GenBank, que permitiu obter sequências de DNA para os répteis de Cabo Verde, bem como de possíveis espécies ancestrais. As sequências, de DNA mitocondrial e DNA nuclear, foram descarregadas em formato fasta, e utilizando o programa Geneious, foi possível efetuar revisões e correções nas mesmas. O alinhamento foi também feito com recurso a esta ferramenta, que disponibiliza vários pacotes acessórios, em concreto o programa de alinhamento MAFFT. Outros três programas de domínio geral, BioEdit, DNASp e MEGA foram utilizados para verificar a qualidade das sequências e dos alinhamentos. O programa DNASp foi também utilizado para correr análises de polimorfismo e haplótipos, que foram depois úteis para análises posteriores. Utilizando o programa MEGA, construímos árvores filogenéticas utilizando métodos simples, como a Máxima Parcimónia, que permitiu verificar possíveis erros ou problemas nos dados. Foi encontrado um elevado número de sequências, em particular para as espécies endémicas em Cabo Verde, sendo que o número de sequências de genes de regiões do DNA mitocondrial, era muito superior em relação aos genes do DNA nuclear. No total foram recolhidas 1725 sequências de DNA (1447 originárias de Cabo Verde), provenientes de 15 genes diferentes e um total de 67 espécies de répteis. De modo a minimizar possíveis erros aquando a construção das árvores, foi realizada uma análise preliminar para selecionar as melhores sequências. Esta análise teve em conta a sua representatividade para cada espécie e gene (i.e., se o individuo a qual pertencia tinha sequências disponíveis para outros genes), o alinhamento obtido e por fim as árvores criadas com estes dados. Deste modo reduziu-se a redundância dos dados e o tempo de processamento das várias análises, bem como a qualidade dos resultados obtidos. Para tal foram realizadas várias análises filogenéticas para cada um dos genes, bem como criados ficheiros concatenados, utilizando o programa Concatenator, dos genes mitocondriais, nucleares e ambos, para analisar os resultados em conjunto. Para avaliar os modelos e partições associados aos nossos dados, foram feitas análises com o programa PartitionFinder. Os modelos e partições obtidos nestas análises foram depois introduzidos em três ferramentas de construção de árvores filogenéticas - RAxML, MrBayes e BEAST (incluindo a versão mais recente e o pacote *BEAST2) – que são atualmente os programas mais usados no estabelecimento das relações filogenéticas. O primeiro programa (i.e. RaxML), utiliza o método de máxima verosimilhança; complementarmente foi utilizando um outro programa – RAxMLGUi – que facilitou a conexão direta para os servidores da plataforma Cipres Gateway. Esta plataforma online, providencia servidores para diversas ferramentas de análise filogenética, tendo sido usada para correr as nossas análises com o RAxML, MrBayes e BEAST. Deste modo, foi possível reduzir substancialmente o tempo de processamento dos programas, bem como providenciar um local secundário para guardar alguns dos dados. Para testar os resultados obtidos com Inferência Bayesiana, utilizamos o programa MrBayes para as análises “clássicas” e a ferramenta BEAST na sua versão base e utilizando a mais recente versão do pacote *BEAST2, para fazer datações nas análises. Os resultados obtidos com estes programas foram verificados com a ferramenta Tracer, para assegurar a convergência dos vários parâmetros durante as várias corridas realizadas. Para além destas análises, pretendemos testar possíveis eventos de recombinação e hibridização genética, tendo sido para o efeito construídas redes filogenéticas para cada um dos géneros utilizando vários programas, como o SplitsTree4. Os resultados obtidos explorando diferentes ferramentas bioinformáticas, permitiram construir um grande número de árvores filogenéticas, reveladoras das relações evolutivas entre várias espécies de répteis das ilhas da Macaronésia. De uma forma geral a topologia obtida foi semelhante à obtida em estudos anteriores, com resultados ligeiramente melhores nas análises que usaram Inferência Bayesiana. As redes filogenéticas criadas apresentaram um reticulado que parece indiciar que terão de facto ocorrido a presença de eventos de hibridização e recombinação nas linhagens de Cabo Verde nos três géneros analisados, sendo necessárias análises complementares para clarificar estes resultados. Os resultados sugerem diferentes origens para cada género, e revelaram diferentes padrões e eventos de colonização nas ilhas de Cabo Verde. O género Chioninia terá tido origem em linhagens africanas, apresentando uma maior semelhança ao género Trachylepis, oriundo de África com exceção de um espécime do Brasil. As espécies de Hemidactylus endémicas em Cabo Verde apresentam uma relação com espécies de São Tomé e Príncipe (África), Trindade e Brasil (América Latina), o que põe em evidência a grande capacidade de dispersão deste género, inclusive através do Oceano Atlântico. Por fim, as espécies de Tarentola endémicas em Cabo Verde, parecem ter evoluído de ancestrais que colonizaram outras ilhas da Macaronésia (i.e. Canárias e Selvagens) e que diversificaram no Norte de África, com um possível ancestral na América Central. A aplicação do relógio molecular usando métodos Bayesianos (MrBayes, BEAST e *BEAST2) permitiu testar hipóteses evolutivas, sugerindo que o género Chioninia terá sido o primeiro a colonizar Cabo Verde, a partir de ancestrais da região Centro Africana, tendo colonizado este arquipélago há cerca de 16,7 milhões de anos. As espécies de Hemidactylus terão colonizado as ilhas de Cabo Verde a partir de espécies ancestrais africanas que diversificaram nas ilhas entre 2,4 – 11,5 milhões de anos. Por fim, o género Tarentola poderá ter tido origem no final da época do Mioceno (5,8 – 7,5 milhões de anos), com uma grande diversificação no arquipélago entre 5,1 – 5,8 milhões de anos, a partir de ancestrais das ilhas das Canárias e do Norte de África. Os resultados obtidos no presente estudo oferecem uma nova compreensão sobre a história evolutiva de um dos maiores grupos da fauna terrestre das ilhas da Macaronésia – os répteis, que apresentam o maior centro de diversidade nas ilhas de Cabo Verde. Com o elevado número de métodos, programas e dados utilizados, foi possível construir árvores filogenéticas e aplicar técnicas de datação molecular inovadoras, como é o caso do *BEAST2, para os répteis de Cabo Verde. Contudo, para além dos tempos de divergência das diferentes espécies, podia-se ter explorado as áreas de distribuição ancestral e com base nos resultados dessas análises propostos cenários biogeográficos, para além dos evolutivos agora apresentados. Por fim, refira-se que os ecossistemas insulares, reconhecidos como laboratórios naturais, mostraram mais uma vez serem são modelos únicos para testar métodos e programas bioinformáticos, evidenciando a grande utilidade da existência de programas e tutoriais disponíveis online e gratuitamente, permitindo ter uma base muito bem suportada para explorar qualquer análise na área da Biologia Evolutiva.The interdisciplinary field of bioinformatics was born from the need to develop and employ methodologies to study large amounts of biological data, namely proteins and DNA. Many science areas benefited greatly from the introduction of specialized and powerful tools that improved the implementation of databases, data analysis and biological interpretations. For evolutionary study fields such as phylogenetics, the knowledge jump has been substantial since the introduction of bioinformatic methods in their analysis. Making use of highly advanced software packages is now possible to perform high-throughput DNA sequencing, and thoroughly analyse this data with several methods of phylogenetic inference, to obtain informative and well supported phylogenies. Even though many important evolutionary discoveries were made in the last few years, understanding the evolutionary origin of biological diversity on island ecosystems is still a critical issue within the hotspot area of the Macaronesia Islands (i.e. Azores, Canary Islands, Madeira and Cape Verde). One of the least studies archipelagos is Cape Verde, which houses a huge diversity of endemic species whose evolution is still largely understudied. In these islands, the reptiles are one of the most diverse radiations among the terrestrial groups, hosting three genera with 22 endemic species. Chioninia, a group of skins formerly included in the genus Mabuya; Hemidactylus, a widespread and diverse group of house geckos; and Tarentola, a genus of wall geckos that also occurs on other Macaronesia archipelagos. Some of these species are single islands endemics (SIE) and are threatened species, which puts them at high risk of extinction. This study aims to reconstruct a phylogeny for this group with large-scale taxon sampling using a wide sample of the most current bioinformatic tools available. DNA data was retrieved from the Genbank and subsequently analysed using several software packages for alignment, model fitting and finally phylogenetic inference. The collected data was composed of 1725 DNA sequences (1447 coming from Cape Verde) and 15 different genes, which originated from a total of 67 reptilian species. Both approaches – Maximum Likelihood and Bayesian Inference – were used to achieve more thorough results. Divergence time estimation was also performed using a classical BEAST and *BEAST2 across the three reptile groups to assess their evolution story in the Cape Verde Islands. Phylogenetic networks were also created to assess possible hybridization or recombination events in the Cape Verdean reptiles. This macroevolutionary perspective also combines data from ecology and distribution of the species to an integrated vision of Cape Verde evolution of terrestrial biodiversity. The results suggest different origins for each genus and different colonization patterns and events along the Cape Verde Islands, ranging from the Macaronesia region to Africa and South America: i) Chioninia originated 21.7 – 39.6 Mya, radiating along the islands 14.9 – 18.5 Mya, with a probable colonization from central African regions; ii) the Hemidactylus species having colonized the archipelago 2.4 – 11.5 Mya and originating from African ancestral species; and iii) the endemic Cape Verdean Tarentola are likely descendants of Northern African and Canary Islands lineages, that colonized the islands during the end of Miocene (5.8 – 7.5 Mya) and later diversified (5.1 – 5.8 Mya). In conclusion, presently the huge amount of DNA sequences available in international databases and the most up-to-date bioinformatic tools and methodologies, allow us to contribute to better understand the origin and colonization of insular ecosystems, using insular endemic species, as an excellent case-study in the field of Evolutionary Biology