The molecular mechanisms of autosomal dominant polycystic kidney disease

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2017A Doença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD do inglês Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease) é a causa genética mais comum e a 4ª principal causa de insuficiência renal no mundo, com uma prevalência de 1 em cada 400 a 1000 indivíduos1. Esta doença é causada por mutações nos genes PKD1 (em 85% dos casos) ou PKD2 (nos restantes 15%), os quais codificam as proteínas policistina-1 (PKD1) e policistina-2 (PKD2), respetivamente2. Ambas estão presentes nos cílios (em cílios primários, nos humanos), funcionando a PKD1 como um mecanosensor dos estímulos extracelulares3 e a PKD2 como canal não seletivo de Ca2+ 4. Estas interagem uma com a outra, formando um complexo mecanosensitivo que é essencial para a regulação da homeostase do Ca2+ 5. Quando afetadas, o processo de cistogénese é desencadeado6. A principal manifestação clínica desta doença é o desenvolvimento de múltiplos quistos renais cheios de fluído que vão crescendo em número e tamanho ao longo da vida dos pacientes. Os quistos vão substituindo o parênquima saudável do rim levando ao decréscimo da função renal7. As manifestações extra-renais mais comuns são o desenvolvimento de quistos no fígado e pâncreas e problemas vasculares8. A severidade da doença varia consoante o gene afetado, sendo que geralmente, os doentes com mutações associadas no gene PKD1 têm os fenótipos mais graves 9,10. Na ADPKD existem diversas vias de sinalização alteradas, sendo as principais a do Ca2+ e do AMP cíclico (cAMP). A homeostase do Ca2+ encontra-se alterada, sendo que os seus níveis intracelulares são bastante mais baixos que os fisiológicos. Estas modificações provocam por sua vez um aumento dos níveis de cAMP, quando comparados com os níveis fisiológicos8. Os níveis elevados de cAMP levam à hiperestimulação da proteína responsável pelo insuflamento dos quistos, a CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Esta é uma proteína membranar que atua como um canal de Cl- e que nas células epiteliais dos quistos promove a secreção de Cl-, funcionando como força motriz para a entrada de água para o lúmen dos mesmos11,12. Contudo, o impacto da falta das policistinas na CFTR não está ainda bem clarificado, conduzindo-nos à questão: poderá o impacto ser apenas ao nível da atividade da CFTR ou também afetará os níveis de expressão ou ainda estabilidade da proteína na membrana? Assim, o principal objetivo deste trabalho foi contribuir para o conhecimento dos mecanismos subjacentes a este processo. Para responder a esta questão o modelo usado foi a Vesícula de Kupffer (KV do inglês Kupffer’s Vesicle) do peixe-zebra, órgão que foi anteriormente sugerido pelo nosso grupo como sendo um modelo adequado para estudar os mecanismos moleculares através dos quais os reduzidos níveis de PKD2 levam à anormal ativação da CFTR. Apesar de não ser um órgão relacionado com o rim ou com a função renal, a KV tem algumas semelhanças com um quisto de ADPKD. Como por exemplo o facto de a falta de PKD2 causar um aumento do seu volume e este ser devido à anormal estimulação da CFTR13. Em embriões de peixe-zebra, para efetuar o knockdown de uma proteína, estes são injetados (no estadio de uma célula) com oligómeros específicos, designados por morpholinos, que bloqueiam a tradução do mRNA alvo. A linha de peixe-zebra usada para este estudo foi a linha transgénica TgBAC(cftr-GFP)pd104114 uma vez que, devido à fusão da proteína CFTR com GFP, esta dá-nos a possibilidade observar diretamente a influência dos baixos níveis de PKD2 na CFTR. A expressão de CFTR-GFP foi seguida por esteromicroscopia de fluorescência desde o estadio de 70% de epibolia até aos 12 dias após a fertilização. Na janela temporal usada para a execução das experiências, de 8 a 10 sómitos, a expressão de CFTR-GFP foi apenas detetada na região da KV, como anteriormente descrito14 e manteve-se assim até ao desaparecimento da KV. Após esse período a expressão só foi novamente detetada a partir dos 5 dias, nos ductos pancreáticos e na vesicula biliar. Por microscopia confocal em embriões vivos, foi varrida toda a KV de embriões TgBAC(cftr-GFP)pd1041 não injetados e embriões morphants para a PKD2 (pertencentes à mesma postura). De seguida, com recurso a um software, os volumes das KVs foram medidos e a fluorescência avaliada. Os volumes dos morphants para a PKD2 revelaram-se superiores aos volumes dos embriões não injetados, tal como descrito pelo nosso grupo13. A fluorescência avaliada por este método também se verificou mais elevada nos morphants para a PKD2, tanto na medição efetuada em toda a KV como nas medições feitas apenas na membrana apical da mesma. Estes dados foram posteriormente corroborados por citometria de fluxo. Os resultados obtidos são sugestivos de uma maior expressão de CFTR-GFP quando a PKD2 se encontra em níveis residuais. Contudo, uma análise comparativa de microarray efetuada pelo nosso grupo entre células da KV de embriões normais, de morphants para a PKD2 e de morphants para a CFTR (dados ainda não publicados15), não revelou a existência de alterações dos níveis transcricionais de CFTR quando a PKD2 se encontrava em níveis reduzidos. Assim, os resultados obtidos levam-nos a sugerir que uma maior estabilidade da proteína. Esta hipótese é apoiada pelos resultados obtidos na análise de fluorescência na membrana apical, que nos sugerem uma maior quantidade de CFTR-GFP na membrana de embriões morphants para a PKD2. Na mesma análise comparativa de microarray foi também possível a identificação de alvos comuns para a PKD2 e para a CFTR, nomeadamente genes que codificavam diversos enzimas do metabolismo dos esfingolípidos (dados ainda não publicados15). Este resultado sugere que a diminuição dos níveis de PKD2 afeta a homeostase celular dos esfingolípidos, uma hipótese apoiada por estudos referentes à acumulação de dois tipos de esfingolípidos em pacientes de ADPKD 16,17. Existem também referências na literatura que associam a CFTR a este metabolismo18,19, pelo que se tornou relevante para nós aprofundar esta matéria. O outro grande objetivo deste trabalho foi então apurar em que medida as alterações no metabolismo dos esfingolípidos podem afetar a CFTR. Por citometria de fluxo e usando a mesma linha transgénica de peixe-zebra a influência de alterações do metabolismo dos esfingolípidos na CFTR-GFP foi avaliada. Para tal, foram comparados embriões incubados com 50 μM de Miriocina (um inibidor do primeiro passo do metabolismo dos esfingolípidos), embriões incubados com 0,5% de DMSO (usados como controlo) e embriões sem qualquer tratamento. Após 4 repetições da experiência e a análise dos resultados, não foi obtida qualquer diferença nos níveis de fluorescência de CFTR-GFP destes três grupos. Considerámos, no entanto, que estes resultados requerem uma confirmação futura a alguns problemas técnicos no decorrer da experiência. Contudo, como a CFTR também é extensamente estudada em células de mamífero, decidimos investigar a influência da Miriocina na CFTR, em células HEK293-CFTR. Estas células estavam estavelmente transduzidas com wtCFTR20 e segundo a nossa análise de western-blot expressam também endogenamente a PKD2. Por imunofluorescência foi avaliada a influência da Miriocina na localização subcelular da CFTR. Comparando as diferentes amostras (controlo, incubação durante uma noite com 100 nM de Miriocina e a incubação com 20 μM de Miriocina durante 2 e 4 horas) verificámos algumas diferenças na localização da CFTR. Sendo estas: vesículas que aparentavam estar a sair das células, a acumulação de CFTR na membrana de algumas células e a acumulação intracelular de CFTR em pequenos aglomerados. O rácio desta distribuição foi calculado para todas as amostras e as diferenças entre os controlos e as diferentes incubações com Miriocina foram avaliadas. O número de vesículas revelou-se mais elevado quando as células eram incubadas com Miriocina, tendo a incubação de 100 nM durante uma noite apresentado as maiores diferenças. A acumulação de CFTR na membrana das células também se mostrou igualmente superior quando estas eram incubadas com Miriocina, sendo que mais uma vez, a incubação noturna de 100 nM foi a mais relevante. Juntos estes resultados parecem sugerir que quando o metabolismo dos esfingolípidos é afetado, o tráfego da CFTR também o é. Em conclusão, os reduzidos níveis de PKD2 podem afetar a CFTR não só ao nível da sua atividade, mas possivelmente também ao nível da sua expressão e estabilidade membranar. Adicionalmente o metabolismo dos esfingolípidos pode ter um papel associado a esta influência, pelo que esta hipótese deve ser cuidadosamente avaliada no contexto da ADPKD.The Autosomal Dominant Polycystic Kidney disease is the most common genetic disorder and the fourth leading cause of renal failure. The cause for this condition are mutations in PKD1 or PKD2 genes, which encode the proteins Polycystin-1 and 2, respectively. These, when disrupted, trigger cystogenesis. The main clinical manifestation of ADPKD is, therefore, the development of massive fluid filled kidney cysts, whose inflation is mediated by CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Abnormal activation of CFTR has been reported to occur in cyst-lining cells in response to their increased intracellular cAMP levels. But, is this exclusively dependent on enhanced activity or does it also involve higher expression levels of CFTR? The main objective of this study was to contribute to the knowledge of the underlying mechanisms of this process. We used as working model the zebrafish Kupffer’s Vesicle (KV), an organ that was previously showed by our group as suitable to study the inflation of ADPKD cysts. Mimicking them, the knockdown of PKD2 causes a CFTR-mediated enlargement of the KV. The zebrafish line used in this study was the transgenic TgBAC(cftr-GFP)pd1041 which provides a KV specific GFP-reporter, since at these early stages of development CFTR-GFP was only detected in KV-lining cells. To perform the PKD2 knockdown, TgBAC(cftr-GFP)pd1041 embryos were injected at their one-cell stage with an antisense MO against pkd2 mRNA. Using confocal live-microscopy and flow cytometry, the mean fluorescence intensity of both PKD2 knocked down and non-injected embryos was determined. The obtained results were indicative of a higher expression of CFTR-GFP in the KV, namely at its apical membrane, when PKD2 is downregulated. However, we knew from a previous microarray analysis of the lab (unpublished data) that lower levels of PKD2 did not change CFTR transcriptional levels. Thus, our data point to an enhanced stability of CFTR at the cell membrane. Results from the mentioned microarray analysis also revealed PKD2 and CFTR common gene targets. Among these were enzymes from the sphingolipid metabolism. Although in a different context, the association between CFTR and the sphingolipid metabolism has been already reported. To better understand this, the impact of the sphingolipid metabolism impairment by Myriocin on CFTR was evaluated. Flow cytometry results performed with TgBAC(cftr-GFP)pd1041 embryos indicated no impact in the CFTR-GFP amounts. Yet, preliminary results of in vitro assays using HEK293 stably transduced with wild type CFTR, suggest changes of the intracellular trafficking of CFTR. In a near future, we aim to evaluate both parameters in the knockdown of PKD2. Together our results suggest that the absence of PKD2 is indeed, directly or through changes in the sphingolipid metabolism, enhancing the stability of CFTR