Microplastics as vectors of heavy metals for fish

Tese de mestrado, Ecologia Marinha, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Os ecossistemas marinhos têm sofrido inúmeras pressões resultantes das atividades antrópicas. Mais recentemente tem-se verificado uma preocupação crescente em relação à poluição por plásticos no ambiente marinho, que tem vindo a aumentar ao longo dos anos e é expectável que perdure por muitos mais. Os ecossistemas costeiros são considerados como sendo zonas muito vulneráveis à contaminação por plástico, uma vez que se encontram mais perto das fontes de poluição. Estima-se que cerca de 50- 80% dos resíduos de plástico se encontrem nos ecossistemas costeiros. O plástico, é constituído por diversos materiais sintéticos que lhe conferem grande diversidade de formas e tamanhos. A sua durabilidade, utilização insustentável e má gestão do seu uso, têm permitido a sua crescente utilização na sociedade, tendo como consequência a contaminação de diversos habitats naturais. Não só a poluição pelo plástico apresenta graves consequências para o ambiente marinho, como, por exemplo, perda de biodiversidade, mas também constitui uma ameaça para a saúde humana. Apesar das severas consequências da poluição por plásticos nos ecossistemas aquáticos, apenas na década de 1970s, surgiram os primeiros estudos sobre esta temática. Ao longo dos anos seguintes, este assunto ganhou interesse por parte dos média, do público e, principalmente, da comunidade científica. Recentemente o número de estudos acerca do mesmo aumentou drasticamente, abrangendo não só as áreas da biologia marinha, da toxicologia, da oceanografia e da ecologia, mas também, as áreas da bioquímica e da engenharia ambiental. Sob condições ambientais normais, o plástico de grandes dimensões é degradado, através de processos físicos e químicos, em plásticos de reduzidas dimensões. Os microplásticos, são assim designados por possuírem dimensões inferiores a 5mm. Na última década, vários estudos evidenciaram a presença de microplásticos em diversos ecossistemas marinhos. A crescente preocupação com esta temática, levou ao desenvolvimento de estudos que permitem entender os perigos da contaminação do plástico nos organismos marinhos. Inicialmente, estes estudos foram focados na ingestão e emaranhamento de plásticos de grandes dimensões em tartarugas marinhas, aves marinhas e mamíferos marinhos. Atualmente, existem alguns estudos publicados acerca dos efeitos resultantes da ingestão dos microplásticos em outros organismos marinhos. Informação relativa à sua distribuição temporal e espacial também tem vindo a revelar-se bastante útil, fornecendo uma perspetiva mais global da distribuição e densidade dos microplásticos nos oceanos. Apesar das dificuldades em quantificar a concentração de plásticos nos oceanos, principalmente, devido ao custo elevado e ao tempo necessário, é fundamental entender quais as fontes e formas dos detritos, para que seja possível avaliar as transformações do mesmo após entrar no ambiente marinho. Estes aspetos são fundamentais para compreender os riscos e os impactos da contaminação dos oceanos pelo lixo marinho. Deste modo, tem sido possível entender quais as zonas de maior e menor acumulação de microplásticos, assim como, a evolução crescente da quantidade de microplásticos que acaba nos oceanos anualmente. Outro aspeto fundamental revelado pelos estudos diz respeito à capacidade que os microplásticos possuem em adsorver outros contaminantes, como metais pesados, aumentando, deste modo, o nível de toxicidade para os organismos que os ingerem. O reduzido tamanho e as características hidrofóbicas dos microplásticos permitem a adesão de poluentes orgânicos persistentes (POP’s), que por sua vez, resistem à degradação química, fotolítica e biológica, persistindo no ambiente e contaminando os organismos marinhos. No entanto, muita informação ainda se encontra em falta referente aos efeitos celulares da contaminação por microplásticos nos organismos marinhos. Este estudo pretende determinar, pela primeira vez, os efeitos da contaminação por microplásticos e o seu papel como vetores de metais pesados em peixes, tendo o sargo-comum (Diplodus sargus) como espécie modelo. Foram recolhidos indivíduos juvenis nas poças intertidais de três praias no Cabo Raso, Cascais, transportados para laboratório, e posteriormente, colocados em aquários com condições controladas. Ao fim de um período de aclimatização de 10 dias, com alimentação com camarão, foi iniciada a experiência, na qual os indivíduos foram alimentados com 1) camarão (controlo), ou 2) camarão + 8 microesferas virgens (0,1% p/p poliestireno virgem) ou 3) camarão + microsferas de plástico contaminadas por metais pesados (0,1% p/p poliestireno virgem). Ambos os tratamentos, juntamente com o controlo, foram replicados por três aquários. Durante o período experimental foi registada a mortalidade diariamente. Após 30 dias de exposição, seis indivíduos foram retirados ao acaso dos respetivos aquários, pesados, medidos e congelados a -80°C, para análise posterior. Foi determinada a condição corporal dos indivíduos (através do índice de Fulton-K) e a resposta ao stress celular (através dos biomarcadores de stress oxidativo), em vários tecidos, numa experiência a longo-prazo (30 dias). As atividades das enzimas Glutationa-S-Transferase (GST), Catalase (CAT), e Superoxide Dismutase (SOD) assim como a concentração de Peroxidação Lipídica (LPO) foram determinadas em diversos órgãos – fígado, intestino, músculo e brânquias. A concentração de Ubiquitina foi determinada apenas no fígado. O principal objetivo do presente trabalho foi determinar as respostas celulares dos diversos biomarcadores nos vários tecidos, para os vários tratamentos. Com a informação obtida foi possível avaliar o efeito de stress oxidativo provocado pela contaminação por plásticos e por metais pesados nos diversos tecidos. O uso dos biomarcadores de stress oxidativo tem vindo a revelar-se extremamente importante na compreensão dos mecanismos celulares de defesa contra diversos tipos de stress (térmico, radiação UV e poluição). Existe já literatura acerca do stress oxidativo, em diversos organismos marinhos, sujeitos a diferentes condições de stress. Sabe-se que sob condições de stress, os organismos produzem e acumulam espécies reativas de oxigénio (ROS), causando um desequilíbrio de oxidantes e antioxidantes no organismo, levando a danos nas membranas lipídicas, nas proteínas e nos ácidos nucleicos. Como resposta, os organismos desenvolveram mecanismos de defesa para combater a toxicidade causada pelas espécies reativas de oxigénio. O equilíbrio entre a eliminação e a produção de ROS é mantida por antioxidantes e por enzimas. As enzimas antioxidantes (ex: GST, CAT, SOD) atuam de forma a proteger as células dos efeitos nocivos causados por ROS. Por outro lado, a LPO e as Ubiquitinas fornecem informação de danos ao nível das membranas celulares e de danos nas proteínas, respetivamente. A sua eficácia depende do estágio de desenvolvimentos e de outros aspetos fisiológicos dos organismos. Neste sentido, este estudo vem realçar a importância do papel dos biomarcadores de stress oxidativo na compreensão dos efeitos celulares da contaminação por metais pesados em peixes costeiros. Este trabalho revelou que a contaminação somente por microplásticos virgens leva a níveis baixos de stress oxidativo, já que se verificou um aumento apenas em um biomarcador, a GST, e apenas num dos tecidos testados, o músculo. Já a hipótese de que os microplásticos serão potenciais vetores de metais pesados, confirmou-se. O tratamento contendo microplásticos com metais pesados, levou a um aumento significativo nas atividades e concentrações da LPO no músculo, da GST nas brânquias, da CAT e da Ubiquitina no fígado. O intestino, por sua vez, foi o único tecido que não respondeu significativamente a nenhum biomarcador. Contrariamente, o músculo foi o tecido onde se observou uma resposta mais significativa dos biomarcadores analisados, nomeadamente a GST e LPO, o que sugere que este tecido pode ser o mais indicado para biomonitorizar este tipo de poluição. Foi registada uma ligeira mortalidade em todos os tratamentos, tendo ocorrido um aumento da mesma em ambas as experiências comparativamente com o controlo. O índice corporal Fulton-K não variou significativamente entre as experiências, indicando que o stress causado aos indivíduos não foi severo o suficiente para induzir um decréscimo na condição corporal dos mesmos. Concluindo, este projeto revela, pela primeira vez, o papel dos microplásticos como vetores de metais pesados em peixes, tendo-se obtido resultados significativos em quatro dos cinco biomarcadores de stress oxidativo testados, em vários tecidos. Tendo sido esta experiência realizada num período de 30 dias e com juvenis, permite-nos ter uma perspetiva dos possíveis danos celulares que poderão ocorrer num período de exposição mais prolongado a este tipo de contaminantes, e possíveis alterações no desenvolvimento e crescimento de indivíduos a partir desta fase do ciclo de vida.This project aimed, to determine if microplastic can act as vectors for heavy metal contamination in fish, using juvenile white seabream (Diplodus sargus) as model organism. It its known that heavy metal contamination affects the cellular systems of the contaminated organisms, and so, the purpose of this study was to investigate the cellular impacts of heavy metal contamination via microplastics in several tissues of the white seabream, in a long-term experience (30 days). After being collected in their natural habitat, individuals were placed in aquaria under controlled conditions. Juveniles of D. sargus were fed with 1) shrimp (control), 2) shrimp containing virgin microplastic beads (0.1% w/w of virgin polystyrene) and 3) shrimp containing microplastic beads contaminated with Cu and Zn (0.1% w/w of virgin polystyrene). Whole-body (survival and Fulton-K index) and cellular stress (oxidative stress biomarkers) indicators were assessed in a long-term experiment (30 days). The enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione S-transferase (GST) as well as Lipid peroxidation (LPO) concentration were determined in the liver, intestine, muscle and gills. Ubiquitin concentration was determined only in the liver. Results showed the lack of cellular response after contamination with virgin microplastics, for the exception of GST in the muscle. Conversely, our data points for a connection between heavy metal contamination and oxidative stress, since we reported an increase in the activities and concentrations of LPO in the muscle, GST in the gills, CAT and an increase of Ubiquitin concentrations in the liver. The intestine was the only tissue that not responded significantly to any of the tested biomarkers. In contrast, the muscle was the tissue that responded to more biomarkers, namely GST and LPO, and therefore, it was considered the most suitable tissue for biomonitoring this type of pollution. A slight mortality was recorded in all treatments, with an increase occurring in both experiments compared to the control. The Fulton-K body index did not vary significantly between the experiments, indicating that the stress caused to the individuals was not severe enough to induce a decrease in their body condition. Concluding, this work shows, for the first time, the oxidative stress of heavy metals contamination via microplastics, in fish, in a long-term experience. The role of microplastics as heavy metals vectors was clear in our study. Also, this project showed that Diplodus sargus is a good model-species for this kind of studies