Oligometastatic prostate cancer: characterization of its molecular phenotype

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O Cancro da Próstata (CaP) é o tipo de cancro mais comum a afetar os homens. Tem uma incidência de 22,8% na Europa, e é o terceiro cancro responsável por mais mortes, ultrapassado pelo cancro do pulmão e do colon. Os CaP são, na grande maioria, adenocarcinomas, e têm origem nas células luminais das glândulas prostáticas. Estes tumores são caracterizados pela proliferação de células que se assemelham, tanto em estrutura como em bioquímica, com as células luminais, e pela ausência de células basais, sendo que estas últimas são as células que fazem a barreira entre as glândulas e o estroma na próstata normal. Ainda não há certezas sobre quais são as causas deste tipo de cancro, mas o aumento da idade, etnicidade e hereditariedade são fatores de risco já identificados. A partir de uma coorte de 29 pacientes com Cancro da Próstata Oligometastático (CaP-OM), obtivemos onze amostras de tecido de oito doentes, conservadas em blocos de parafina. Estas amostras foram analisadas e comparadas, após a realização de um protocolo de imunofluorescência com cinco biomarcadores (5-plex), que nos possibilitou observar a expressão de múltiplas proteínas numa única imagem. O estado oligometastático (OM) designa que o doente tem um número limitado de lesões metastáticas (entre três a cinco metástases, mas apenas até três nestes doentes), e aparenta ser um estado intermédio entre cancro da próstata confinado ao órgão, e um estado polimetástatico (PM), de doença já disseminada pelo corpo, onde a probabilidade de sobrevivência é muito baixa. Um estudo realizado pelo Dr. Carlo Greco na Fundação Champalimaud permitiu observar que alguns doentes com CaP-OM, cujas metástases foram tratadas com Radioterapia de dose única (SDRT de ‘Single Dose Radiotherapy’), normalmente 24Gy numa única sessão, responderam melhor ao tratamento, e ficaram num estado de doença controlado. A existência de uma estratificação entre doentes com CaP-OM que respondiam, ou não, ao tratamento com SDRT levou a sugerir que existiria um verdadeiro estado OM, o qual apresentaria uma biologia tumoral característica, ainda potencialmente curável. Há cada vez mais uma necessidade de encontrar novos biomarcadores que possam auxiliar o diagnóstico clínico de doentes com CaP, colaborando com o tão conhecido exame do nível de PSA (antigénio específico da próstata) sanguíneo que, até aos dias de hoje, continua a ser a principal ferramenta utilizada no diagnóstico e seguimento dos doentes. No entanto, este exame tem sido alvo de muitas controvérsias, pois apresenta uma especificidade baixa, tal devido ao facto de algumas condições benignas poderem levar a elevações no nível desta proteína e, consequentemente, a falsos diagnósticos e a tratamentos excessivos e desnecessários. O protocolo de coloração utilizado neste estudo foi adaptado de um protocolo criado e optimizado no Centro Hospitalar Mount Sinai, em Nova Iorque. Este protocolo continha cinco anticorpos todos com interesse na identificação e caracterização dos CaP. Estes anticorpos permitiram fazer uma definição do tecido e rapidamente identificar estruturas normais contra tumor, possível através da utilização do anticorpo para a citoqueratina 18 (CK18), uma citoqueratina de baixo peso molecular que marca células epiteliais das glândulas prostáticas, normais e tumorais. O recetor de androgénio, AR, e a racemase ametilacil coenzima A, AMACR, já são conhecidos por terem especial interesse para a progressão do CaP, e por serem utilizados como apoio nos diagnósticos executados pelos médicos patologistas. O AR é um recetor nuclear ativado pela ligação de hormonas androgénicas, como a testosterona. Este é muitas vezes encontrado sobre-expressado nos tumores. Contudo, quer a sobre-expressão, quer o silenciamento deste gene, são ambos fenómenos relacionados com a transição para um estado independente de androgénios que, por sua vez, está relacionado com um pior prognóstico para os doentes. A AMACR é uma enzima que tem um papel importante no metabolismo dos ácidos gordos, e também se encontra muitas vezes com níveis elevados no CaP. A PSMA (antigénio membranar especifico da próstata) é uma glicoproteína transmembranar não secretada, normalmente também encontrada elevada no CaP. O Ki-67 é uma proteína nuclear que marca células em proliferação, e a percentagem de expressão desta proteína está muitas vezes correlacionada com a progressão clínica de vários cancros, o da próstata é um deles. Este projeto faz parte de um estudo piloto, no qual o objetivo é gerar um algoritmo inovador para o diagnóstico e seguimento da doença, utilizando dados clínicos retrospetivos, juntamente com dados fenotípicos e moleculares, permitindo fazer uma seleção de quais os doentes com CaP-OM que terão maior probabilidade de beneficiar com um certo tratamento e, consequentemente, maior probabilidade de sobrevivência. Assim, este projeto em específico tem o intuito de fazer uma descrição de alguns casos CaP-OM, abrindo caminho para uma possível caracterização do estado OM, através de diferenças encontradas entre os fenótipos moleculares nas amostras das biópsias prostáticas iniciais e das metástases, comparando também os resultados dos pacientes já falecidos com os que ainda estão vivos e a responder aos tratamentos. No momento do diagnóstico, os oito pacientes apresentavam uma idade média de 61,9 anos e um PSA inicial médio de 11,3 ng/mL. A maior parte deles apresentava tumores no estágio TNM (“Tumor, nodes, metastasis”) de T2, ou seja, tumores primários confinados na próstata. Nesta coorte de pacientes o local mais comum de primeira metástase foi nos nódulos/órgãos linfáticos, seguidos por metástases no osso, pulmões e cérebro. O caso único de metástase na glândula adernal constitui uma metástase atípica do CaP. O local da primeira metástase e distribuição das metástases têm mostrado ter grande impacto na prognose clínica e probabilidade de sobrevivência destes doentes. Dois destes doentes, que apresentavam semelhante diagnóstico inicial e percurso clínico de tratamento, exibiram evoluções clínicas muito diferentes, um deles falecendo por progressão cerebral. Nestes a grande diferença foi o local da primeira metástase. Aquele cuja primeira metastização foi no osso exibiu uma evolução tumoral mais rápida, não respondendo aos tratamentos, quer de terapia hormonal quer de radioterapia. A radioterapia tem um papel muito importante no controlo tumoral e na cura de todos os doentes. No entanto, e tal como podemos concluir com o grupo de doentes estudados, muitos são tratados com terapia hormonal, utilizada especialmente como primeiro tratamento, para além da cirurgia (prostatectomia radical ou parcial). O segundo tratamento, esse sim, é normalmente radioterapia, SBRT (stereotactic body radiotherapy), SDRT ou ambos. A microscopia de fluorescência parte do principio da utilização de feixes de emissão de luz fluorescente com diferentes picos de excitação no espectro visível da luz. A microscopia multiespectral utiliza vários filtros de longa emissão que permitem a captura do sinal de emissão de mais de cinco biomarcadores diferentes, pela utilização de anticorpos marcados com tags fluorescentes, cujos picos de excitação e emissão são distintos, e não sobreponíveis. Após a criação de uma “biblioteca multiespectral” com os picos de emissão para todos os marcadores utilizados (AMACR, AR, CK18, Ki-67, PSMA) e DAPI, foi possível obter imagens complexas que continham uma grande quantidade de informação molecular. A análise semiautomática das imagens de amostras de cancros primários e metástases permitiu observar que as metástases apresentavam maior heterogeneidade intratumoral, com grande variação na expressão dos biomarcadores. Três pacientes, um deles morto, permitiram fazer uma comparação dos fenótipos moleculares das amostras primárias com metástases, fazendo uma observação da progressão tumoral ao longo do tempo. Nestes doentes, as alterações examinadas entre biópsias separadas no tempo foram significativas para os marcadores PSMA e AMACR. Para além desses, o Ki-67 apresentou sempre um aumento de expressão estatisticamente significativa, revelando o potencial deste biomarcador como indicador de progressão tumoral. A análise de sobrevivência, pelas curvas Kaplan-Meier, apresentou resultados interessantes pois observámos que doentes apresentaram níveis baixos de marcadores como AR e Ki-67 exibiram maior probabilidade de sobrevivência. A análise de todas as amostras possibilitou a identificação de um possível fenótipo ao qual corresponde maior agressividade tumoral, associado a um pior cenário clínico e a uma maior probabilidade de recorrência tumoral. Este corresponde a uma elevada expressão do AR, Ki-67 e possivelmente também dos marcadores AMACR e PSMA, embora estes apresentem uma expressão mais variada entre os pacientes. A perda de expressão de biomarcadores como AR e PSMA, também mostrou ser um sinal de progressão, observado nalguns pacientes com pior prognóstico. Todos os pacientes que apresentaram o Ki-67 sobre-expressado, com valores acima dos 20%, não responderam aos tratamentos e acabaram por morrer da doença. Tal insinua que este marcador poderá ter elevada importância como ferramenta para gestão clínica de pacientes num estado mais avançado da doença, assim como para previsão da progressão tumoral e resposta aos tratamentos, nomeadamente RT.Prostate Cancer (PCa) is the most common malignancy affecting men. PCa is a clinically heterogeneous disease, both histologically and clinically, what implies variability in patient outcomes. Novel biomarkers for outcome prediction are urgently needed aiding the postoperative monitoring of high-risk patients. Our working hypothesis contemplates that Oligometastatic PCa (OM-PCa) represents a potentially curable early metastatic phase. This project included eight OM-PCa retrospective consented patients who received radiotherapy (RT) treatment at the Champalimaud Clinical Centre, for whose we got eleven tissue samples in FFPE blocks corresponding to primary tumor and metastasis. Using a multiplex immunofluorescence (IF) assay and multispectral microscopy we analyzed the expression of multiple biomarkers (CK18, AR, AMACR, PSMA, and Ki-67) and DAPI as a counterstain in a single image, quantifying the expression levels in a semi-automated way using an open image analysis software. This project aimed to generate a novel diagnostic algorithm for OM-PCa using retrospective clinical data, molecular and phenotypic signatures of tissue samples, eventually enabling the stratification of patients per individual risk, possible phenotypic signatures and tumor response to treatments. The eight patients presented a mean age and PSA at diagnosis of 61,9 years, and 11,3 ng/mL, respectively. After the initial diagnosis, the great majority of the patients underwent hormone therapy (HT) or surgery (radical prostatectomy – RP). The most common second and third treatments, corresponded to RT, either SBRT (stereotactic body radiotherapy) or SDRT (single dose radiotherapy). Out of the eight patients, three died of the disease with a mean follow-up of 111,6 months, and another three, for whose we had more than one tissue sample available, allowed the analysis of changes in the tumor phenotype with time. The potential of the multiplex IF technique in research is vast, since it allows the visualization and quantification of multiple biomarkers that are spatially distributed along the tissue and co-expressed at the sub-cellular level. The comparison between the molecular phenotypes of the primary PCa and metastatic samples showed that the later tissues presented greater biomarkers expression variability amongst patients. Ki-67 showed an interesting and statistically significant increase in time, being overexpressed in all analysed metastatic tissues, suggesting that this marker may be associated with tumor progression and the acquisition of a more aggressive phenotype. The impact of the metastasis site in the patient’s prognosis and probability of survival has received growing importance, showing that patients whose first metastatic site is the bone present higher probability of recurrence and tumor progression, which was observed in this group of patients. In conclusion, a possible aggressive molecular phenotype, associated with a worse disease scenario and shorter recurrent-free survival, would present high expression of AR, Ki-67 and possibly overexpression of AMACR and PSMA, although these latter are very heterogeneously expressed along metastatic samples