Decoding the mechanism of motor plasticity during gait recovery after injury in Drosophila melanogaster

Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Coordinated walking in vertebrates and multi-legged invertebrates, such as Drosophila melanogaster is controlled by an evolutionarily conserved network capable to control the movement in a fast, stable, and energy-efficient way. But sometimes due to physical challenges, aging and other factors, the reliable and stereotyped walking process can be compromised. To overcome these challenges, some imposed by disease or injury and others by external conditions, the network displays neural plasticity that allows humans, but also fruit flies demonstrate an adaptive motor behavior. Currently, this adaptation mechanism is partially understood and despite the large investments in the field of neurorehabilitation and some improved methodologies, the recovery outcomes are nevertheless considerably variable amongst individuals. This elusiveness is largely due to the absence of an appropriate model to study this process and facilitate the design of approaches to identify new mechanisms required for motor plasticity. Therefore, we aim to establish the fruit fly as a genetic model for neurorehabilitation. For this purpose, we used a detailed gait analysis system, that allows the quantification of several kinematic features with high temporal and spatial resolution. Based on these quantifications, we found that both male and female flies in which the two middle legs were amputated could walk immediately after motor injury, although in a very uncoordinated way. Nevertheless, over the course of a few days, the fruit flies could improve their gait performance gradually, engaging in a more controlled locomotion. Moreover, older flies displayed a consistent decline of motor control and a gradual lack of motor recovery, coherent with observations in elderly patients. Contrary to our initial hypothesis, the gradual lack of motor recovery cannot be explained by their lower exploratory activity. These results suggest that flies can readjust their motor circuitry upon injury and the motor recovery process is dependent on gender, age and activity. This study will open new doors to a better understanding of the locomotion process under injury conditions. In future, it may help to develop or improve new therapeutic approaches, like targeted bio-inspired machines, in order to enhance the recovery outcomes.A coordenação locomotora em vertebrados e artrópodes com múltiplos apêndices articulados, como na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é controlada por uma rede neuronal evolutivamente conservada. Esta rede neuronal complexa é formada pelo sistema nervoso, músculos e órgãos sensoriais que interagem constantemente e recebem informações do meio ambiente para ajustar o controlo do movimento, garantindo que a sua execução seja feita de uma forma rápida, estável e eficiente em termos energéticos. No entanto, frequentemente devido a doenças neurodegenerativas, doenças motoras, envelhecimento e outros fatores, esse controlo e, como consequência, a locomoção é seriamente comprometida. Para superar estes desafios, alguns impostos por doenças ou lesões e outros por condições externas do meio envolvente, a rede neuronal é capaz de exibir plasticidade neural, que permite aos seres humanos, mas também às moscas da fruta demonstrarem um processo de aprendizagem, que garante a adaptação motora às novas condições biomecânicas. Atualmente, este mecanismo de adaptação e de aprendizagem é parcialmente compreendido e, apesar dos grandes investimentos no campo da neurorehabilitação e do aperfeiçoamento de algumas metodologias, os resultados da recuperação neuromotora são, no entanto, consideravelmente variáveis entre os indivíduos e, por vezes incompleta. Essa parcial compreesão deve-se em grande parte à ausência de um modelo apropriado para estudar este processo e facilitar o desenho de novas abordagens para identificar os mecanismos necessários para a plasticidade motora. Por estas razões, a proposta do presente trabalho é estabelecer a mosca da fruta como um modelo de neuroreabilitação. Para além da similaridade existente ao nível dos circuitos neuronais responsáveis pelo controlo da coordenação motora, as moscas da fruta apresentam uma locomoção estereotipada e estável, de fácil caracterização. Para tal, foi usado um sistema ótico baseado na dispersão da luz internamente refletida, que permite caracterizar detalhadamente a locomoção com uma grande resolução quer temporal, quer espacial. Neste sistema foi integrado o software FlyWlaker especificamente criado para este propósito. As características cinemáticas quantificadas permitiram determinar a dimensão do tamanho de cada passo, a duração necessária para a execução de um passo completo, a velocidade atingida de cada pata durante cada passo, o tipo de marcha, à coordenação entre patas, a linearidade do movimento de cada pata em relação ao centro do corpo, entre outras. De acordo com estas quantificações, verificou-se que as moscas da fruta de ambos os géneros, nas quais as duas patas do meio foram amputadas, podiam caminhar imediatamente após a lesão motora, embora de uma forma muito descoordenada. Naturalmente, a amputação comprometeu o acoplamento mecânico existente entre as patas, reduzindo a sua coordenação e obrigando um ajuste do tipo de marcha assumido. Antes da amputação, a coordenação das patas podia ser executada segundo quatro tipos de marcha, sendo a mais comum o tripé. No entanto, após amputação este tipo de marcha ficou completamente comprometida e as moscas foram obrigadas a reajustar o acoplamento mecânico das patas, assumindo novos tipos de marcha, característicos dos animais quadrúpedes. Ao longo de alguns dias, verificou-se, de facto, que as moscas eram capazes de melhorar o seu desempenho motor de uma forma gradual, conseguindo ajustar-se às novas condições biomecânicas por forma a ter uma locomoção mais controlada e coordenada. Essa adaptação motora passou por um aumento da linearidade do traçado obtido pelo contacto de cada pata em relação ao centro do corpo. Para além disso, verificou-se um aumento do cluster formado pelas pegadas de cada pata. Este aumento de linearidade e da consistência das pegadas é indicativo do aumento da coordenação motora, como resultado da reorganização e do remapeamento das representações motoras para compensar progressivamente os padrões de locomoção desfavoráveis. E, apesar de se ter verificado que esta adaptação motora era comum em ambos os géneros, constatou-se que as fêmeas apresentavam uma curva de recuperação mais gradual, enquanto os machos apresentavam algumas oscilações ao longo de todo o período de recuperação observado. As possíveis justificações para estas diferenças residem nas diferenças anatómicas, como por exemplo no peso e tamanho. De uma forma geral, como os machos eram menores e mais leves, as propriedades cinemáticas da sua locomoção e, por sua vez, o processo de recuperação motora eram distintas das fêmeas. Com o objetivo de investigar o efeito do envelhecimento nas propriedades cinemáticas da locomoção e no processo de neuroreabilitação motora, aplicou-se o mesmo protocolo em moscas do género feminino com idade avançada. Neste caso, foi verificada a inexistência de recuperação motora ao longo de todas as idades, consistente com observações em pacientes humanos. Esta inexistência de recuperação foi evidenciada pela dispersão do cluster obtido pelas pegadas e pela diminuição da linearidade do traçado de cada pegada, evidenciando que o controlo motor se ia deteriorando ao longo das semanas e que a capacidade de se ajustar às novas condições biomecânicas impostas pela amputação era reduzida. Como possível justificação para estes resultados foi considerada a hipótese de que moscas com idade mais avançada possuíam uma menor atividade locomotora. Esta hipótese não foi totalmente comprovada. Inicialmente, pensou-se que após 1 semana todos os parâmetros iriam diminuir gradualmente. E, apesar de se ter verificado este decréscimo gradual ao longo das semanas, essa diminuição ocorreu a partir das 3 semanas. Na maioria dos parâmetros cinemáticos observou-se a existência de grandes diferenças significativas para as moscas com 3 semanas relativamente aos restantes estágios etários. Posteriormente, constatou-se, de facto, a existência de um pico positivo em todos os parâmetros quantificados para a atividade exploratória. E, contrariamente ao expectável, observou-se que esse aumento era muito mais significativo para moscas com uma idade igual a 3 semanas. Neste estágio etário pareceu existir uma otimização do controlo motor, manifestado por um aumento abrupto da distância total percorrida e, consequentemente da atividade exploratória bem como da velocidade média. Além disso, verificou-se que a recuperação motora após amputação era bem mais eficaz, dado que a maioria dos parâmetros alcançavam os valores controlo, em contraste com os resultados previamente quantificados. Por último, nas moscas com 7 semanas de idade, o efeito da amputação é praticamente nulo, indicando que nesta fase etária o seu normal controlo motor é semelhante à perda de controlo motor induzido pela a amputação das duas patas médias. Adicionalmente, constatou-se em alguns parâmetros a existência de similaridade entre moscas de 1 e 7 semanas. Isto poderia indicar que o processo de aprendizagem motora evidenciada pelas moscas de 1 semana era limitado, mas que, apesar disso, estas tinham uma plasticidade motora mais elevada que as faria ajustar-se melhor às novas condições biomecânicas. E o nível do processo de aprendizagem assemelhar-se-ia à perda de capacidade de aprendizagem das moscas com 7 semanas. Estas não apresentavam qualquer melhoria do controlo motor porque a plasticidade motora seria menor devido à natural senescência. Adicionalmente, o processo de aprendizagem estaria optimizado às 3 semanas de idade. A partir daí, a natural senescência motora em conjugação com a redução da capacidade de aprendizagem causaria a diminuição gradual da capacidade de adaptação. Em suma, estes resultados sugerem que as moscas conseguem reajustar os seus circuitos neuronais após a lesão motora e o processo de recuperação motora depende do gênero, idade e da atividade locomotora. Assim, este estudo pode abrir novas portas para uma melhor compreensão do processo de locomoção em termos cinemáticos e, no futuro, pode ajudar a desenvolver ou melhorar novas abordagens, como máquinas biomédicas direcionadas para melhorar os resultados da recuperação motora