Characterization of metabolic pathways involved in the compatible interaction between Vitis vinifera and Plasmopara viticola

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A videira (Vitis vinifera L.) é a planta de fruto mais cultivada em todo o mundo, devido aos vários produtos de elevada importância económica, em particular o vinho, mas também as uvas, passas de uvas, folhas, entre outros. O ano passado (2016) as plantações de videira a nível mundial cobriam uma área de 7.5 milhões de hectares. Entre os vários produtos que podem ser extraídos ou colhidos das videiras, o vinho é sem dúvida o mais rentável e relevante. Apesar da produção total de vinho não ter crescido significativamente nos últimos anos, a procura tem vindo a impulsionar a indústria vinícola para novos recordes, atingindo um valor de mercado superior aos 29 biliões de euro, um crescimento de aproximadamente de 40% nos últimos 6 anos. Em Portugal, a videira, também desempenha um papel essencial ao nível da nossa cultura e economia, sendo que o ano passado (2016) as exportações de vinho arrecadaram cerca de 738 milhões de euros. Portugal está entre os 10 maiores produtores de vinho e apresenta a segunda maior variedade de cultivares a nível mundial, numa área de cultivo superior a 190 mil hectares. No entanto a maioria das variedades utilizadas para o fabrico de vinho são suscetíveis a vários patogénios. Uma das doenças mais ameaçadoras para a produção vitícola no continente europeu é o míldio da videira. Esta doença, causada pelo oomicete obrigatório Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, afeta a maioria das castas de Vitis vinifera utilizadas para o fabrico de vinho. As infeções por P. viticola afetam não só as folhas, mas também os rebentos e os frutos, e têm impactos negativos nas produções de videira, levando a grandes perdas das colheitas e redução da qualidade dos frutos e consequentemente elevados impactos económicos. Sob condições adequadas, isto é, humidade elevada e temperatura moderada (entre os 22 e 25 °C), os oósporos germinam, dando origem a zoosporângios que libertam zoósporos capazes de aderir à face abaxial das folhas. Uma vez germinados, os zoósporos, entram através dos estomas, para a cavidade estomática, onde se dá o desenvolvimento das hifas primárias e micélio. As hifas e o micélio invadem os espaços intercelulares, levando invariavelmente à invaginação da membrana plasmática das células do parênquima. O micélio também se desenvolve e emerge através do estoma sob a forma de esporangióforos, libertando esporângios que levam a infeções secundárias em tecidos próximos suscetíveis (folhas, ramos, frutos) e ainda a outras plantas. Atualmente as estratégias de controlo assentam-se no uso de pesticidas e fungicidas, que se podem tornar perigosos para o meio ambiente e para os humanos. Plantações de videiras não protegidas por qualquer tipo de controle de pragas, arriscam-se a sofrer perdas superiores a 75% da produção anual, o que acarreta custo muito elevados. As alternativas ao uso de pesticidas recaem na criação de híbridos entre as variedades suscetíveis, que têm grande qualidade de uva e boas propriedades para o fabrico de vinho, e variedades americanas e asiáticas que são tolerantes ou resistentes à infeção. Esta última abordagem é claramente mais eficaz e sustentável, no entanto também traz os seus problemas associados. Cruzamentos de modo a criar híbridos de interesse ou até mesmo a transformação de videiras pode demorar vários anos, o que se tornam processos muito longos e dispendiosos. Frequentemente a diferença entre uma variedade resistente e uma suscetível é uma questão de amplitude e/ou afinamento da resposta de defesa. Como tal, o estudo de interações compatíveis (suscetível) é tão importante como o estudo de interações incompatíveis (resistentes). Interações compatíveis podem fornecer importantes informações relativas aos diferentes mecanismos de defesa presentes, mas também ajudar no desenvolvimento de novas estratégias de defesa e identificar fatores relevantes na progressão da doença. Vários estudos têm sido feitos no âmbito de aprofundar o conhecimento destas interações compatíveis e de conhecer melhor como se processa a infeção numa variedade suscetível. De modo a compreender os marcadores genéticos associados à resistência e/ou falta deles, as analises de Quantitative trait Loci (QTL) têm sido fundamentais na identificação de múltiplos loci de interesse. Até agora 16 loci de Resistência de Plasmopara viticola (RPVs) foram descritos. A análise de transcritómica em interações com míldio de videira é frequentemente utilizada quer em larga escala (microarrays e sequenciação de RNA) quer em pequena escala (usando a Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR)). No caso das interações compatíveis com P. viticola, é descrita uma redução dos transcritos de genes relacionados com a fotossíntese, e um aumento insuficiente de genes relacionados com a defesa a patogénicos e reguladores de resposta a estímulos. Em paralelo estudos ao nível da proteómica também têm vindo a elucidar a interação planta-patogénio. Após infeção com P. viticola, folhas de cultivares suscetíveis acumulam certas proteínas alergénicas relacionadas com defesa, mas também glicoproteínas associadas na desregulação dos estomas. Apresentam também fosforilação associada a proteínas do metabolismo e fotossíntese. Na área da metabolómica o número de estudos em interações compatíveis entre a videira e o P. viticola são reduzidos. Em trabalhos anteriores utilizando ressonância nuclear magnética de protão (H1NMR), identificámos um número reduzido de metabolitos modulados em V. vinífera cv Trincadeira pela interação com oP. viticola.No âmbito deste trabalho, a caracterização metabólica das primeiras horas da interação compatível, entre a variedade suscetível Trincadeira com o P. viticola, foi realizada por espectrometria de massa de ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourier (FTICR-MS). Esta técnica apresenta uma elevada sensibilidade de poder de resolução permitindo uma caracterização metabólica mais detalhada. Os resultados obtidos, após a inoculação, sugerem modelação lipídica tal como do metabolismo dos carboidratos, de modo que análises complementares foram realizadas de modo a melhor caracterizar estes processos. Análise por Cromatografia gasosa revelou diferenças nos principais ácidos gordos em folhas infetadas, do mesmo modo que as análises por qPCR revelaram modulação nas vias dos Flavonoides. A quantificação dos açucares nas folhas também revelou diferenças no conteúdo de carboidratos. Estes dados sugerem que as variedades suscetíveis tentam iniciar um processo de defesa, mas esta não é robusta o suficiente para impedir o desenvolvimento do P. viticola, acabando por se dar inicio à infeção.Grapevine (Vitis vinifera L.) is the most widely cultivated and economically important fruit crop in the world. Last year the total area worldwide under vines crops was 7.5 million hectares, for grape, dried grape and wine production. This reflects a market value over 29 billion euro for the wine industry alone. The domesticated varieties of grapevine are highly susceptible to many fungal infections, of which downy mildew (DM) is one of the most threatening. Downy mildew is caused by the biotrophic oomycete Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl.et de Toni affecting the leaves, shoots and fruits, reducing berry quality and yield, with significant production losses. Currently the most widely used strategy for pathogen control is the use of powerful fungicides, in many cases very prejudicial to human health. Another alternative is the development of new hybrid grapevines that combine good berry quality and high degree of resistance, which usually can take upwards of 2-3 years. Having in mind these shortcomings, the investigation of compatible interaction can provide information on the availability of defense mechanism, but also help in the development of new control strategies and possible define alternative control methods. In the present work, the metabolic characterization of the first 24 hours of infection, regarding the establishment of the compatible interaction between Vitis vinifera cv Trincadeira (susceptible cultivar) and Plasmopara viticola were characterized. The metabolic changes were characterized by Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance MS (FTICR-MS), Gas Chromatography (GC), quantitative real-time PCR (qPCR), and by the quantification of important biological markers, such as ROS, lipid peroxidation and photosynthetic pigments. Our results show that, following inoculation, Carbohydrates and Lipid metabolism reveal pathogen-derived modulation, being lipid variations largely due to Flavonoids and Fatty acids differences. The present study supports the idea that susceptible cultivars try to mount a defense response but are unable to properly respond to the pathogen