Metabolomic analysis of the reconstructed epidermis cultivation protocol as a tool to improve the skin barrier properties

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Atualmente existe uma grande procura de cosméticos e de produtos tópicos para a pele. No entanto, estes produtos podem conter substâncias que podem passar a barreira da pele, por permeabilidade, e causar efeitos tóxicos para o organismo, sendo necessário testá-los sempre, antes que estejam disponíveis comercialmente. Até recentemente, os procedimentos de teste destes produtos mais utilizados eram realizados em animais ou com recurso a pele de cadáveres humanos. Contudo, ainda que a pele de cadáver humano permita replicar com alguma fidelidade a permeabilidade da pele in vivo, esta não pode ser estabelecida como um procedimento padrão uma vez que existe grande variabilidade de amostra para amostra, para além de as células não estarem funcionais. Por outro lado, a pele de animais é morfologicamente diferente da pele humana. Além das implicações éticas, existem limitações legais para a utilização de animais para testes, estando o uso destes estritamente limitado na União Europeia, bem como em alguns países como os Estados Unidos da América e o Japão. Surgiu assim, nas passadas últimas três décadas um grande interesse comercial em engenharia de pele humana in vitro de forma a desenvolver modelos de pele adequados para a avaliação da segurança dos produtos cosméticos 1,2. Hoje em dia já existem vários modelos de pele disponíveis no mercado, mas ainda que apresentem semelhanças morfológicas e mesmo bioquímicas à pele humana nativa, a barreira da epiderme in vitro é mais permeável que a da pele nativa3. A camada apical da epiderme é o stratum corneum, constituído por corneócitos (queratinócitos que já passaram por um processo de diferenciação e se tornaram células mortas, achatadas e sem núcleo, revestindo esta camada superior da pele e conferindo força estrutural) 2. A envolver estes queratinócitos está uma matriz lipídica responsável pela barreira da pele, e se esta não é suficiente ocorrerá uma maior permeabilidade de substâncias, aumentando a toxicidade avaliada nos testes de produtos cosméticos e dermatológicos1. Surge assim a necessidade de melhorar a barreira da pele cultivada, tendo sido objetivos deste projeto: reconstruir e avaliar epiderme humana in vitro em termos de histologia e permeabilidade, utilizando três fármacos com diferentes polaridades (cafeína, uma substância hidrofílica; hidrocortisona, semi-hidrofílica; e tamoxifeno, uma substância lipofílica); fazer uma análise metabolómica do sobrenadante da cultura celular com recurso a técnicas analíticas como a ressonância magnética nuclear de protão (RMN-1H) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para determinar as taxas de consumo de nutrientes e secreção de metabolitos excretados; desenhar um novo meio de cultura com base na informação obtida com a análise metabolómica e estudar o impacto deste novo processo de cultura na função de barreira da pele. Os queratinócitos proliferaram em cultura em monocamada em T-flasks e o meio de cultura foi substituído regularmente até que as células cobrissem 70-80 % do estrato disponível (confluência). Nesta fase, os queratinócitos foram submetidos a tripsinização para se soltarem da superfície do T-flask e ressuspendidos para serem então colocados em insertos com filtro de policarbonato para reconstrução in vitro de epiderme (RHE) em interface ar-líquido. Ao fim de onze dias nestas condições obteve-se uma epiderme completamente estruturada4 e procedeu-se a uma avaliação histológica utilizando coloração H&E e avaliação da sua função de barreira com três fármacos em células de Franz. Os resultados obtidos foram comparados com estudos anteriores existentes na bibliografia5,6 caracterizando a função de barreira de pele humana nativa e dos modelos EpiDermTM e EpiSkin®. Verificou-se que apesar da epiderme reconstruída cultivada no Laboratório de Diagnóstico Biomolecular de acordo com o protocolo publicado pelo laboratório liderado por Yves Poumay4 ter uma estrutura bem-diferenciada, este tecido tem uma barreira mais deficiente do que os outros modelos. Esperando que um estudo de metabolómica do sobrenadante dos queratinócitos cultivados in vitro permitisse uma melhor compreensão do que está a ocorrer aos metabolitos no meio de cultura, um novo conjunto de células foi semeado para se fazer uma recolha do sobrenadante ao longo de todo o processo de cultura e reconstrução de epiderme. Com recurso a RMN-1H, uma técnica analítica muito promissora no campo da metabolómica devido à simplicidade na preparação das amostras e na capacidade de identificação de metabolitos de uma forma não enviesada, vários metabolitos foram detetados e quantificados no meio de cultura, incluindo alguns produzidos pelos queratinócitos como o lactato, formato, urocanato, entre outros. Contudo, esta técnica tem uma desvantagem em relação a outras que é a baixa sensibilidade e alguns constituintes do meio de cultura não puderam ser identificados, incluindo vitaminas, quer porque poderiam estar em baixas concentrações ou mesmo porque ficavam escondidas por sinais de maior intensidade emitidos por outros metabolitos. Foi o caso particular de três aminoácidos, a asparagina, aspartato e cisteína, que ficavam escondidos por um sinal muito amplo emitido pelo tampão HEPES. Como os queratinócitos durante a fase de diferenciação são caracterizados por uma grande produção de proteínas estruturais nos diferentes estratos da epiderme, é de vital importância que tenham sempre disponibilidade de aminoácidos7. Como tal, era necessário determinar as concentrações dos 3 aminoácidos que não foram quantificados por RMN, recorrendo-se a CLAE para o fazer. Por sua vez, os níveis de amónia no meio foram também analisados através de um kit comercial para o efeito. A determinação dos aminoácidos por RMN e por CLAE permitiu a comparação dos resultados para verificação da confiança da técnica de RMN. Dado que por CLAE é permitida a realização de uma quantificação absoluta com recurso a soluções-padrão de aminoácidos e curvas de calibração das mesmas e que RMN é uma técnica menos sensível, e visto que o erro de medição entre ambas as técnicas era relativamente baixo (cerca de 11,5 %), utilizaram-se as medições aos aminoácidos feitas por CLAE para a análise metabolómica, à exceção do triptofano. Este apresentou um erro de medição de 181% entre as duas técnicas, sendo isto explicado pela presença de dois grupos fluorescentes (o reagente de derivatização e o próprio triptofano) que levam à redução da sensibilidade de fluorescência na técnica de CLAE. Para este aminoácido utilizaram-se então os valores obtidos com RMN-1H. Após a determinação das concentrações dos metabolitos calcularam-se as taxas de consumo ou secreção destes face ao número de células em T-flask ou o volume de pele no inserto com filtro de policarbonato. Verificou-se que durante a fase de diferenciação dos queratinócitos em cultura na interface ar-líquido existe um grande consumo de glucose e concomitante produção de lactato até ao quinto dia, a partir do qual se parece verificar uma inversão do metabolismo para metabolismo de síntese de proteínas que requer uma maior quantidade de aminoácidos, sendo estes mais consumidos nesta fase. Devido a esta observação, um novo meio de cultura contendo uma maior concentração de aminoácidos selecionados foi desenhado e testado em nova cultura de equivalentes de epiderme. Os testes de permeabilidade com os três fármacos-modelo mostraram que a epiderme obtida era ainda mais permeável do que a obtida com o método de cultura convencional. Foi determinado o teor de proteína total em pele cultivada neste novo meio desenhado e pele cultivada em meio normal, conforme o protocolo, para verificar se o facto de se ter adicionado mais aminoácidos levava a uma maior produção de proteína. Contudo, não se observaram diferenças estatisticamente significativas (p = 0,05) no teor de proteína total extraído da epiderme cultivada pelos diferentes métodos. A metabolómica tem muitas potenciais aplicações, incluindo determinação de inibidores de crescimento/diferenciação, compreensão do metabolismo de fármacos ou modelação de sistemas biológicos8,9, e muitos outros testes e estudos podem ainda vir a ser feitos com o intuito de melhorar a barreira da pele, como nomeadamente, fazer análise metabolómica ao meio intracelular. Este projeto poderá vir a completar estudos prévios com o intuito de descobrir formas de melhorar a função de barreira dos equivalentes de epiderme humana.There is a trend to develop experimental approaches to replace animal testing. In which concerns the evaluation of skin toxicity induced both by cosmetics and pharmaceutical products, there are already several reconstructed skin models commercially available. However, even though they show morphological and biochemical similarities to native human skin, the skin barrier of the in vitro reconstructed epidermis model is considerably different and more deficient than the barrier of the native skin. A deficient barrier allows a higher permeability of substances, thus increasing the evaluated toxicity, being desirable to improve the barrier of cultivated skin. In this work, a metabolomic analysis of the supernatant of the culture process (exometabolome) was performed by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) and high-performance liquid chromatography (HPLC). The uptake and secretion rates for both the expansion of keratinocytes in monolayer culture and the reconstructed epidermis were determined for the several metabolites observed by NMR, and for the amino acids. During the culture at the air-liquid interface, it was verified that there is a high consumption of glucose and concomitant production of lactate until the fifth day, after which an inversion of this metabolism occurs into a protein synthesis metabolism, that requires a higher amount of amino acids, thus these being more consumed at this stage. Due to this observation, a new culture media three times more concentrated in selected amino acids was tested in the culture of a new batch of epidermis equivalents. The morphology of the epidermis cultivated with the new culture medium evidenced a well differentiated tissue, containing the usual strata. The barrier function of the reconstructed epidermis was characterized by the determination of the maximum flux of three model drugs with different polarities, caffeine, hydrocortisone and tamoxifen in Franz cells. The epidermis obtained with the new culture media was more permeable than the tissue cultivated in standard conditions. Despite the cultivation with increased amount of amino acids in the culture media, the total protein content of the reconstructed epidermis did not change