The role of ABC proteins in the mechanism of action of promising ruthenium anticancer agents

Tese de mestrado em Química, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O cancro é um termo genérico para um vasto grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do nosso corpo. Esta doença é definida pela proliferação anormal de células. Estas células anómalas podem invadir outros tecidos e órgãos formando assim metástases. O cancro, considerado uma doença mundial e que afeta diversas faixas etárias, continua a ser uma preocupação para a população e, nomeadamente, para os cientistas. A investigação nesta área já é longa e felizmente conta já com importantes avanços. No entanto, apesar de todos os progressos, continuam a existir obstáculos para o tratamento cem por cento eficaz. Um desses obstáculos é a resistência das células cancerígenas aos fármacos, o que limita consideravelmente a eficácia dos mesmos. Esta resistência deve-se a vários fatores sendo, um deles, a existência de um tipo de proteínas transportadoras, denominadas transportadores ABC, que se encontram sobre expressas nas células cancerígenas e que atuam sobre os fármacos levando ao seu rápido efluxo para fora da célula limitando, assim, a sua capacidade de ação sobre as células cancerígenas. A resistência a fármacos refere-se à capacidade das células cancerígenas para resistirem a uma variedade estrutural de fármacos anticancerígenos, levando a um dos maiores problemas da quimioterapia. Na realidade, este tipo de resistência é responsável pelo fracasso de mais de 90 % dos tratamentos em cancro. A família ABC (ATP binding cassette) é constituída por várias proteínas, sendo que atualmente as mais conhecidas, e aqui estudadas são: P-gp ou ABCB1, MRP1 ou ABCC1, MRP2 ou ABCC2 e ABCG2 ou BCRP. Apesar de existirem várias teorias que procuram explicar os seus mecanismos de ação, a certeza é que estas proteínas transportadoras permitem a expulsão dos fármacos, aumentando, em consequência, a resistências das células cancerígenas a estes fármacos. Os estudos de elucidação dos mecanismos bioquímicos que permitem combater esta resistência aos fármacos têm-se centrado principalmente na identificação de inibidores seletivos destas proteínas que bloqueiem a passagem dos fármacos para o exterior da célula cancerígena. A maior limitação até agora tem sido encontrar inibidores específicos para cada transportador, que ao mesmo tempo apresentem baixa citotoxicidade para células saudáveis e de alta eficiência. Por isso, a investigação nesta área continua a ser uma prioridade. Foi neste âmbito que o Laboratorio de Química Organometálica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal, juntamente com o “Drug Resistance and Membrane Proteins team” em Lyon, França, avaliou, durante a realização desta tese de Mestrado, o papel que diversos transportadores ABC têm no mecanismo de ação de uma família de complexos organometálicos de ruténio ciclopentadienilo, “RuCp” (Cp = η5-C5H5). Foram estudados sete compostos, todos contendo o fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’, com potencial atividade anticancerígena e anteriormente desenvolvidos pelo Laboratório de Química Organometálica. Entre eles, encontram-se os compostos de ruténio-polímero PMC78 e PMC85 que foram escolhidos devido ao seu elevado peso molecular que permite uma maior facilidade de acumulação destes compostos no interior das células pelo efeito de EPR (“enhanced permeation and retention effect”). Para além disso, estes compostos revelaram melhores citotoxicidades que a cisplatina para as linhas celulares do ovário A2780 e mama MCF7 e MDA-MB-231, e parecem ser capazes de ultrapassar os mecanismos de resistência de células cancerígenas (resultados obtidos por comparação entre a linha celular A2780 sensível e A2780CisR, resistente à cisplatina) . Para além destes compostos, foi também escolhido o composto PMC79, composto parental dos anteriores, com a mesma estrutura, mas sem as cadeias de polímero na sua estrutura. O composto PMC79 apresenta uma boa citotoxicidade relativamente à cisplatina para as mesmas linhas celulares. No entanto, para este composto o nível de acumulação nas células A2780 sensíveis foi muito superior que nas resistentes. Devido a estes resultados, o PMC79 foi também escolhido para este trabalho para se tentar perceber em maior detalhe qual o(s) transportadores ABC responsáveis por este efeito. O composto LCR134, [Ru(η5-Cp)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3], foi também escolhido uma vez que é baseado no PMC79, mas onde foram adicionadas duas moléculas de biotina (vitamina H ou B7) à bipiridina. A inclusão desta biomolécula poderá ser vantajosa devido à capacidade de se ligar a recetores da membrana celular das células cancerígenas. A biotina é essencial para o nosso organismo e tem sido frequentemente utilizada em diversos estudos reportando a sua facilidade de transporte para dentro das células cancerígenas. Os três compostos restantes, pertencem à subfamília de ruténio η5-metilciclopentadienilo e foram escolhidos com o objetivo de se conseguir obter uma correlação entre a sua atividade biológica e os substituintes na bipiridina. Desta forma, para se estudar o papel dos transportadores ABC no mecanismo de ação destes compostos, utilizaram-se diversas técnicas, tais como o teste de viabilidade celular para avaliar a citotoxicidade de cada composto através do cálculo do IC50, citometria de fluxo para verificar a percentagem de inibição de cada composto para os transportadores ABC, citometria de massa para quantificar a percentagem de acumulação do ruténio nas células, e docking molecular para a caracterizar a ligação de compostos ao sitio ativo da proteína P-gp. Todos os compostos obtiveram bons resultados ao nível da citotoxicidade para a linha celular cancerígena 2008C (1.1 - 4.5 μM), assim como bons níveis de internalização celular de ruténio. Os resultados obtidos permitiram concluir que compostos mesmo estruturalmente muito similares, possuem atividades biológicas distintas. Verificou-se que os compostos de ruténio-polímero, PMC78 e PMC85, são mais citotóxicos para células sobre expressas com transportadores (P-gp e MRP1, respetivamente) do que sem transportadores. O PMC78 demonstrou também que seria um bom inibidor para a P-gp. Todos estes fatores levaram a indicar que o uso do polilactídeo poderá potenciar a ação anticancerígena de compostos não poliméricos. Observou-se também que o uso do fragmento da bipiridina funcionalizada com duas moléculas de biotina poderá potenciar a capacidade anticancerígena dos compostos, visto que o complexo LCR134 revelou ser muito bom inibidor da P-gp. Cálculos de docking molecular mostram que é possível que haja competição entre o LCR134 e o conhecido substrato Rodamina 123 pelo centro ativo da P-gp . Os compostos LCR136 e RT11, pertencentes à família η5-MeCp, foram os compostos que revelaram os melhores resultados ao nível das suas atividades inibidoras e a melhor internalização para as linhas com os transportadores ABC estudados, sugerindo uma correlação entre as suas atividades e a sua internalização celular. Para além disso, revelaram melhor citotoxicidade para células sobre expressas. Os compostos PMC79 e RT12, são os compostos estruturalmente mais parecidos, onde a única diferença é a existência do grupo metil no ciclopentadienilo para o RT12. Os resultados mostraram que estes dois compostos têm atividades biológicas muito parecidas. Ambos são mais citotóxicos para as células sem sobre expressão de transportadores do que para as células sobre expressas e parecem não terem qualquer efeito inibitório para este tipo de células resistentes, contrariamente aos outros compostos estudados. Concluindo, pode-se afirmar que o grupo -CH2OH, comum aos dois compostos e que os distingue dos restantes, terá um papel importante no efluxo dos mesmos, tornando-os substratos dos transportadores ABC. Decorrente da avaliação dos estudos biológicos realizados, foi sintetizado com sucesso um novo complexo de ruténio, [Ru(η5-(Me-C5H4)(PPh3)(bipiridina-biotina)][CF3SO3] (Ru2). Este composto foi analisado por técnicas espetroscópicas como o RMN (1H, 31P, 13C e técnicas bidimensionais), UV-Vis e FT-IR, e a sua pureza foi determinada por análises elementares. O complexo revelou também adequada estabilidade em meio celular (variação menor que 5 % às 24 h) e caráter lipofílico (logPo/w= 1,6), o que nos assegurou continuação para os estudos biológicos neste novo composto. Foi então avaliado, para Ru2, a viabilidade celular nas linhas celulares utilizadas anteriormente. Contrariamente aos resultados previamente obtidos, este novo complexo de ruténio é muito menos citotóxico para NIH3T3 WT, NIH3T3-P-gp e 2008C, sendo que não é citotóxico para as outras linhas celulares estudadas. Percebe-se também que este composto é um substrato para a P-gp e não tem qualquer efeito inibitório para esta ou outra proteína transportadora. Concluindo, pode-se afirmar que a coordenação da biotina e do grupo η5-MeCp na mesma estrutura parece modificar a capacidade inibitória para P-gp e MRP2 como tinham os compostos LCR134, RT11 e LCR136. Este resultado revelou ser muito interessante, e como tal deve ser explorado em trabalhos futuros. Deste modo este trabalho apresenta pela primeira vez o estudo de novos compostos de ruténio com fragmento ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ em células sobre expressas por transportadores ABC. A descoberta de que estes complexos de ruténio são inibidores para proteínas transportadoras abre novas possibilidades relativamente aos seus mecanismos de ação. Para além disso, tal como observado para outros compostos da literatura, verificou-se que pequenas alterações estruturais desencadeiam respostas biológicas muito diferentes mostrando a importância deste tipo de estudos que relaciona a estrutura com a atividade. O objetivo deste trabalho foi então concluído com sucesso revelando que compostos de ‘Ru(η5-CpR)(PPh3)(bipiridina-R)’ poderão constituir uma ferramenta importante para o combate ao cancro, especialmente em cancros resistentes.Cancer is a global disease that affects most of the age ranges and is still one of the biggest concerns for the scientists worldwide. The research in this area is exhaustive and, fortunately, important developments are done year after year. However, there are some obstacles for the successful treatment such as multidrug resistance (MDR) that limits the drug efficacy. The main reason for this resistance lies in one type of proteins called ABC transporters. These proteins are overexpressed in cancer cell lines and allow the efflux of the drug out from the cell. P-gp or ABCB1, MRP1 or ABCC1, MRP2 or ABCC2 and ABCG2 or BCRP are the most studied proteins belonging to the ABC family. Although the transport mechanism of each pump is still missing, one thing that the scientists are sure is that these proteins are responsible for the efflux of molecules out of the cells. To try to avoid this efflux, the identification of selective inhibitors that block the drugs efflux is being explored. The main challenge of this research is to find compounds that can act as high effective inhibitors while presenting low toxicity for healthy cells. Within this frame, the Organometallic Chemistry Laboratory from Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal, and the Drug Resistance and Membrane Proteins in Lyon, France, studied the role of several ABC transporters on the mechanism of action of new ruthenium cyclopentadienyl compounds “Ru(η5-Cp)”. All the complexes were cytotoxic for the cell lines overexpressed and not overexpressed with ABC transporters and also for one cancer cell line, 2008C. Four compounds (PMC78, LCR134, RT11, LCR136) exhibited specific inhibitory activity for some of the ABC transporters studied. The amount of ruthenium internalization on the cell lines was also quantified by mass cytometry (CyTOF), indicating that, in all cases, the compounds are internalized. A molecular docking study was also carried out for one of the structures (LCR134) in P-gp protein revealing that a competition between LCR134 and the P-gp substrate might happen. With the aim of optimizing the inhibitory activity of this family of compounds, a new ruthenium complex was synthesized, [Ru(η5-MeCp)(PPh3)(bipy-biot)][CF3SO3] Ru2, bearing the structural features inducing the best inhibition effects: a biotin molecule and a η5-MeCp ligand. This compound was characterized by the usual techniques (NMR, UV-Vis and IR spectroscopies) and its purity was assessed by elemental analyses. Ru2 was found to be very stable in cell medium (less than 5% variation over 24 h) and it has an hydrophobic character (logPo/w= 1.6), allowing us to carry on with the biological evaluation. The new compound was evaluated in the same cell lines as the previous compounds. Interestingly, this compound is much less cytotoxic for NIH3T3 WT, NIH3T3-P-gp and 2008C cell lines than the previously compounds studied, and is non-cytotoxic for all the other cell lines. Moreover, it seems that this compound is a substrate for P-gp pumps and does not have any inhibitory effect. To conclude, we can say that the biotin and η5-MeCp motifs in the same complex do not improve the inhibitory potential, resulting, in contrast, in the loss of the inhibitory capacity. Altogether, the proposed aims for this work were successfully achieved and allowed us to unravel an unprecedented mechanism of action for ruthenium cyclopentadienyl complexes that can be used as tool to fight the multidrug resistance in cancer