Living Photonics : Lab-on-a-chip technologies for light coupling into biological cells /

BibliografiaEsta disertación abarca una investigación en tecnologías Lab-on-a-Chip (LoC) que permiten acoplar luz a capas biológicas celulares como biofilms bacterianos o monocapas de eucariotas, con el objetivo de transformar células en componentes fotónicos vivos adquiriendo un rol óptico dual: transdusor y elemento de medición. El concepto de componentes fotónicos vivos supone múltiples posibilidades en su monitoreo sin contacto y mínima invasión del proceso biológico basado en una respuesta espectral autoreferencial a lo largo del tiempo del ensayo. Sin embargo, la implementación de los ya mencionados elementos fotónicos vivos presenta retos multifacéticos: los aspectos biológicos, las simulaciones numéricas, el diseño óptico, los avances en la microfabricación a bajo costo y la adaptación de nuevos materiales para fabricación PhLOC y cultivo celular en la interfaz óptica y el procesamiento de datos. Particularmente, nos centramos en monitorear biofilms bacterianos y monocapas de células de mamífero debido a su relevancia en la salud pública. Los biofilms bacterianos son un gran riesgo a la salud debido a su ubicuidad, dinamismo y resistencia a los biocidas. Razón por la cual requiere un control intensivo, idealmente con disposición de instrumentación miniaturizada. Por otro lado, las monocapas celulares se han estudiado extensivamente por su relación con las afectaciones crónicas como la diabetes y enfermedades cardiovasculares. Nuestras contribuciones sobre las interfaces ópticas se enfocan en conexiones ópticas robustas y estandarizadas desde y hacia PhLoCs, usando un prototipado rápido y económico basado en procesamiento de un laser de CO2. Una caracterización detallada de Polimetilmetacrilato (P12A) mecanizada por laser permite crear conexiones "plug" a conectores de fibra óptica SMA estándar, que se han comparado con sus homólogos comerciales y las cuales son viables para un acoplamiento de luz en guías de onda de capas finas de polímero en una configuración de PhLOC de alta relación Señal-Ruido (SNR). Así mismo, se desarrolló un software modular de interfaces para el control integral del equipo de laboratorio. Este se basó en una el lenguaje de programación libre "Python". Además de encargarse del extensivo procesamiento de datos implícito en el monitoreo de un respuesta espectral, la interacción con el kit de desarrollo de software Qt demostró buenos resultados para representaciones gráficas en tiempo real. Nuestra contribución sobre la instrumentación miniaturizada para la monitorización de las capas de bacterias estaba dirigida a la integración de componentes fotónicos en sustratos termoplásticos (particularmente el P12A). Esto proporciona una plataforma de bajo costo para el estudio de la colonización de superfície en sistemas de distribución de aguas. Al modificar localmente la superficie de la zona de detección, logramos una adhesión preferencial y una detección óptica de bacterias en estadios tempranos de adhesion superficial en condiciones estáticas a través de los segmentos de fibra óptica empotradas en los sustratos modificados. Para la implementación de prototipos que simulen el flujo y las condiciones de presión en los sistemas reales de distribución de agua, también pudimos explorar la integración de guias de onda de polímero con canales de fluido; poniendo en práctica favorablemente nuevas estrategias de fabricación para el encapsulado en P12A de estructuras SU-8 obtenidas por fotolitografía. Utilizando estos dispositivos y explotando nuestros resultados positivos en términos de interconectores ópticos y interfaz informática el monitoreo de una población circular bacteriana arrojó que, bajo estas condiciones, la colonización de superficie bacteriana podría ser asociada con una respuesta espectral characterística con el tiempo. . Finalmente, se han investigado los ajustes necesarios al paradigma PhLoC para la implementación de monocapas celulares de mamífero como componentes fotónicos vivos. Concretamente, dirigimos nuestros esfuerzos en la evaluación numérica y optimización del confinamiento de luz en capas irregulares de ambientes con bajo índice de refracción y el desarrollo de estrategias adecuadas para el confinamiento de luz en dichas estructuras, tomando en cuenta las restricciones biológicas, mucho más evidentes aquí que en el caso de los biofilms. Con este fin, se estudiaron diferentes materiales tanto en cuestión de compatibilidad con las propiedades previamente establecidas, como las técnicas viables de microfabricación y bio compatibilidad. A fin de cuentas, basados en los resultados de los materiales adecuados, se aplicaron dos opciones de arquitecturas PhLoc a culturas celulares in vitro en diferentes etapas de diferenciación o procesos de inflamación, respectivamenteThis dissertation encompasses our research on Lab-on-a-Chip (LoC) technologies enabling light coupling into biological cell layers like bacterial biofilms or monolayers of eukaryotes, with the aim of making the cells act as living photonic components in the dual role of optical transducer and reporter. The concept of living photonics suggests a host of possibilities in terms of contactless and minimal invasive monitoring of biological processes based on a self-referenced spectral response over time. The implementation of such living photonic elements however presented a very multifaceted challenge, ranging from biological aspects over numerical simulations and optical design, advancements in low-cost micro-fabrication and adaptation of novel materials for PhLoC fabrication and cell culture to optical interfacing and data processing. In particular, we focussed on monitoring bacterial biofilms and mammalian cell monolayers for their relevance in public health. Bacterial biofilms are a major risk due to their ubiquity, resistance to biocides and dynamism and therefore require an intensive control, for which miniaturised and affordable instrumentation would be ideal, very few though is available. Cell monolayers on the other hand are studied extensively in relation with chronic conditions like cardiovascular diseases or diabetes, Our contributions regarding optical interfacing focus on robust and standardised optical connections to and from a PhLoC using a low-cost fast prototyping approach based on CO2-laser processing. In particular, careful characterisation of poly-methylmetacrylate (PMMA) laser machining allowed reliable 'plug' connections to standard SMA fiber-optics connectors, which were benchmarked against commercial counterparts and applied to light coupling in thin film polymeric waveguides in a high Signal-to-Noise ratio (SNR) PhLoC configuration. Here, optical simulations were mainly employed in the design. In addition, we developed a modular software interface for integral control of laboratory equipment based on the cross platform and open source programming language Python. Besides taking care of the rather extensive data processing implicit in long-term spectral monitoring via efficient number crunching modules like Numpy, interfacing with the Qt software development kit proved apt for real time graphical feedback with fast response times. Our contributions regarding miniaturised monitoring instrumentation of bacterial biofilms focus on integrating photonic components in thermoplastic substrates - in particular commercial grade PMMA - to provide a cheap platform for the study of biofilm colonisation in water distribution systems. By locally modifying the surface in the detection zone, we achieved preferential adhesion and early optical detection of bacteria in static conditions via fiber-optics segments embedded in the modified substrates. For the implementation of prototypes resembling the flux and pressure conditions in real water distribution systems, we also explored the integration of polymeric waveguides with fluidic channels, successfully implementing novel fabrication strategies for the encapsulation of photolithographically obtained SU-8 structures in PMMA PhLoCs . Using these devices, and exploiting our positive results in terms of optical interconnects and software interface, monitoring of a circulating bacterial population suggested that bacterial surface colonisation can in such circumstances indeed be associated with a distinct spectral response over time. Last, we investigated the adjustments to the PhLoC paradigm necessary regarding the implementation of the much thinner mammalian cell monolayers as living photonics. Concretely, we focussed our efforts on the numerical evaluation an optimisation of light confinement in thin irregular layers in low-refractive index environments and the development of suitable strategies to couple light to such structures, taking into account the biological constrains, which were much more pronounced here as compared to biofilms. To that end, different materials were studied in terms of compatibility with the established material parameters, available microfabrication techniques and bio-compatibility. Finally, based on the results regarding suitable materials, we applied two of the resulting PhLoC architectures to in vitro cell cultures in different stages of differentiation or inflammatory processes, respectively