Sheep experimental model for rift valley fever virus Infection for the study of immunopathogenesis, pathology and vaccinology /

Departament responsable de la tesi: Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals.El virus de la Fiebre del Valle del Rift (RVFV) es un flebovirus zoonótico transmitido por mosquitos que afecta a los rumiantes causando abortos y hepatitis aguda con necrosis multifocal. Los síntomas de la RVF varían desde el síndrome gripal hasta la retinitis y la encefalitis. En esta tesis, mostramos la susceptibilidad leve-subaguda de las ovejas Ripollesas de 9-10 semanas de edad a la infección por RVFV. Cuatro aislamientos virales diferentes de brotes de campo se replicaron de forma eficiente in vivo tras la inoculación subcutánea experimental, detectándose viremia y diseminacion viral dependientes del aislado de RVFV. Se demostró la transmisión horizontal a un cordero centinela no infectado. La infección en corderos únicamente causó pirexia transitoria, aunque se observó opacidad corneal ("ojo azul") en 3 de 16 ovejas inoculadas subcutáneamente. En una aproximación preliminar, se investigó el tejido formolado y parafinado procedente de estos animales afectados por la opacidad corneal mediante histopatología y qRT-PCR, para su caracterización. En cuatro corderos infectados se diagnosticó uveítis anterior con endotelitis linfoplasmocítica. Para evaluar la protección conferida por una única dosis subcutánea de una vacuna de virus Ankara modificado (MVA) que codifica las glicoproteínas Gn y Gc de RVFV en corderos, se inmunizaron 3 grupos de 6 a 7 corderos de 5-7 semanas de edad de la siguiente manera: Un grupo vacunal (denominado rMVA-GnGc), un segundo grupo control vectorial (vector MVA) y un tercer grupo control no vacunado (solución salina). Catorce días más tarde, todos los animales se sometieron a un desafío subcutáneo con 105 TCID50 del aislamiento virulento RVFV 56/74 y se evaluó la eficacia de la vacuna usando puntos finales estándar. Dos corderos (uno del grupo vacunado y uno del control vectorial) sucumbieron al desafío, mostrando lesiones hepáticas características. Los corderos de los grupos control vectorial y control no vacunado fueron febriles de los días 2 a 5 después del desafío (pc) mientras que los del grupo rMVA-GnGc mostraron un único pico de pirexia al día 3 pc. Se detectó ARN de RVFV en ambos hisopados nasal y oral de los días 3 a 7 pc en algunos corderos de los grupos control vectorial y no vacunado, pero no se pudo detectar diseminación viral en los corderos supervivientes vacunados. Caracterizamos patológicamente la nueva lesión ocular detectada en un abordaje secundario. Se seleccionaron 2 grupos de 5 corderos por grupo (n = 10) de la base de datos histórica de infecciones experimentales de RVFV realizadas en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (España, NBS3), en base a sus datos clínicos, viremia y diagnóstico de lesiones ocular y hepática. Se caracterizó la uveítis anterior diagnosticada (8 de 10) con endotelitis linfoplasmocítica (2 de 10). CD3, CD20 e infiltrados inflamatorios mononucleares positivos a la lisozima se observaron en ojos parafinados RVFV-positivos. El marcaje positivo de CD20 sólo se observó en los infiltrados en uvea anterior. También se diagnosticó una nueva retinitis T dependiente (CD3 positivo) en 5 de 10 corderos infectados con RVFV. Se desarrolló un protocolo de inmunoquímica contra RVFV basado en un anticuerpo monoclonal murino. En conclusión, la raza Ripollesa se infecta fácilmente con RVFV sin manifestaciones clínicas evidentes. Un modelo de desafío con corderos de 5 a 10 semanas de edad ha demostrado ser eficaz para testar vacunas. Se sugiere que una sola dosis de la vacuna rMVA-GnGc puede ser suficiente para reducir la diseminación de RVFV y la duración de la viremia, pero no proporciona inmunidad estéril ni protección contra la enfermedad. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción patológica de uveítis anterior con lesión retiniana en un modelo ovino, muy parecida a las lesiones oculares humanas.Rift Valley Fever Virus (RVFV) is a mosquito-borne zoonotic phlebovirus that primarily affects ruminants by causing abortions and acute hepatitis with multifocal necrosis as major findings. Human RVF symptoms range from flu-like syndrome to retinitis and encephalitis. The increasing interest in RVFV deserve revisiting experimental sheep infection. In this thesis, we show the susceptibility of 9-10 weeks old European sheep (Ripollesa breed) to RVFV infection, showing a mild, subacute form of disease. Four different viral isolates from field outbreaks efficiently replicated in vivo after subcutaneous experimental inoculation, and consistent viral loads in blood and RVFV-isolate dependent virus shedding were detected, showing horizontal transmission to a noninfected, sentinel lamb. RVFV infection caused transient pyrexia in old lambs and no other clinical symptoms were observed, although corneal opacity ("blue eye") was found in 3 out of 16 subcutaneously inoculated sheep. To better characterize this corneal opacity, in a preliminary approach, formalin-fixed paraffin wax-embedded tissue from these ocular condition-affected animals was investigated by histopathology and quantitative real time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Anterior uveitis with lymphoplasmacytic endotheliitis was diagnosed in these four RVFV-infected lambs. To evaluate the protection conferred by a single subcutaneous dose of a modified vaccinia virus Ankara (MVA) vectored vaccine encoding the RVFV glycoproteins Gn and Gc in lambs, 3 groups of 6 to 7 Ripollesa lambs of 5-7 weeks old were immunized as follows: one group received the vaccine (termed rMVA-GnGc), a second group received an MVA vector (vector control) and a third group received saline solution (non-vaccinated control). Fourteen days later, all animals were subcutaneously challenged with 105 TCID50 of the virulent RVFV isolate 56/74 and vaccine efficacy assessed using standard endpoints. Two lambs (one from the vaccine group and one from the vector control group) succumbed to RVFV challenge, showing characteristic liver lesions. Lambs from both the vector control and non-vaccinated groups were febrile from days 2 to 5 post challenge (pc) while those in the rMVA-GnGc group showed a single peak of pyrexia at day 3 pc. RVFV RNA was detected in both nasal and oral swabs from days 3 to 7 pc in some lambs from the vector control and non-vaccinated groups, but no viral shedding could be detected in the surviving lambs vaccinated with rMVA-GnGc. We characterize pathologically the new ocular detected condition in a secondary approach. Two groups of five lambs per group were selected (n=10) from the historical database of RVFV experimental infections performed in Center of Research in Animal Health (Spain, NBS3 facility) in the basis of their clinical data, viremia and diagnosed ocular and hepatic lesions (two previous experiments). The previously diagnosed anterior uveitis (8 out of 10) with lymphoplasmacytic endotheliitis (2 out of 10) was characterized. CD3, CD20 and lysozyme-positive mononuclear inflammatory infiltrates were observed in RVFV-positive paraffin-embedded eyes. CD20 labelling was only observed in infiltrates in anterior uvea. A novel T-cell dependent retinitis was also diagnosed in 5 out of 10 RVFV-infected lambs based on CD3-positive labelling. An immunochemistry protocol based on a murine monoclonal antibody was developed at CReSA BLS2 facility. In conclusion, Ripollesa sheep are readily infected with RVFV without apparent clinical manifestations. A 5-10 weeks old Ripollesa breed challenge model has proven to be effective in vaccine testing because of its susceptibility to virus. It is suggested that a single dose of the rMVA-GnGc vaccine may be sufficient to reduce RVFV shedding and duration of viremia but does not provide sterile immunity nor protection from disease. To our knowledge, this is the first pathological description of RVFV-related anterior uveitis with retinal injury in a RVFV-challenge sheep model, resembling ocular human lesions