Estudio fenotípico y molecular de Malassezia pachydermatis y Malassezia furfur aisladas de animales

El género Malassezia está formado por levaduras lipófilas, las cuales son consideradas parte de la microbiota normal de varios animales, incluida la especie humana. En determinadas condiciones, la población de estas levaduras puede proliferar en exceso y causar enfermedades dérmicas y otitis. En perros, la especie más frecuentemente aislada es Malassezia pachydermatis, en la que se ha reconocido una importante variabilidad intraespecífica. La variabilidad dentro de esta especie se estudió mediante métodos moleculares y fenotípicos. Por una parte, se seleccionaron cepas representativas aisladas de distintos animales domésticos y se secuenciaron dos regiones ribosomales y los genes -tubulina y quitín sintasa 2. El estudio de las secuencias obtenidas permitió describir nuevos genotipos. Además, se realizó un estudio filogenético multilocus, en el que se apreció una asociación de algunos genotipos de M. pachydermatis con ciertas especies animales. Los resultados sugirieron que M. pachydermatis está sufriendo un proceso de diferenciación, en el cual las levaduras se estarían adaptando a distintos huéspedes animales. Por otro lado, se estudió la diversidad intraespecífica en M. pachydermatis con métodos fenotípicos. Se emplearon las técnicas clásicamente utilizadas para el estudio de estas levaduras, incluyendo las pruebas fisiológicas de crecimiento a distintas temperaturas de incubación, la actividad catalasa y -glucosidasa y el test de difusión de Tweens y Cremophor EL. Paralelamente, se realizó una modificación del test de difusión mediante el uso de un medio sintético sin lípidos. Usando esta modificación, se obtuvo una mayor eficacia y reproducibilidad en los resultados. Se observó una notable variabilidad intraespecífica dentro de esta especie y se confirmó su naturaleza lipodependiente. Debido a la condición de patógeno oportunista de M. pachydermatis, se diseñó y validó una técnica de PCR a tiempo real para detectar y cuantificar estas levaduras a partir de muestras del conducto auditivo externo de perros. Aplicando esta técnica, se observaron diferencias cuantitativas en la población de M. pachydermatis en perros sanos y en aquellos con otitis externa. Finalmente, se ha estudiado la variabilidad intraespecífica de Malassezia furfur en cepas de animales. Esta especie clásicamente se ha asociado a humanos, aunque recientemente se ha detectado en varias especies de animales. Para este estudio se seleccionaron cepas de M. furfur aisladas de distintos animales domésticos y aves salvajes en cautividad. Por una parte, se realizó un estudio filogenético secuenciando y analizando dos regiones ribosomales y el gen de -tubulina. Este estudio reveló una notable variedad intraespecífica, que podría corresponder a la adaptación de las cepas a distintas especies animales. Por otro lado, se analizaron las mismas cepas con métodos fenotípicos, juntamente con la modificación del test de difusión de Tweens y Cremophor EL. Mediante este estudio, se ha demostrado una importante diversidad fenotípica, a la vez que la modificación del test de difusión de Tweens y Cremophor EL permitió observar mayores diferencias entre las cepas que con la metodología clásica. Además, se ha constatado la presencia de M. furfur en especies animales de las cuales se desconocía.The genus Malassezia includes lipophilic yeasts, which are part of the skin microbiota of various animals, including humans. However, in certain conditions, these yeasts can overgrow and cause diseases like dermatitis and otitis. In dogs, the most frequently isolated species is Malassezia pachydermatis, in which a relevant intraspecific variability has been recognized. The variability within this species was studied with molecular and phenotypical methods. One the one hand, representative strains from different domestic animals were selected and four genes were sequenced, corresponding to two ribosomal regions and -tubulin and chitin sintase 2 genes. The study of the obtained sequences allowed the description of new genotypes. Also, a multilocus phylogenetic analysis was performed, in which a relationship between some genotypes and some animal species was observed. The results suggested that M. pachydermatis is undergoing a differentiation process, in which strains would be adapting to thrive in distinct animal hosts. This intraspecific variability was also studied phenotypically. The traditional techniques for the study of Malassezia yeasts, including the growth at different temperatures, catalase and -glucosidase activities, and ability to assimilate different Tween compounds and Cremophor EL with the Tween diffusion test. On the other hand, we have modified the Tween diffusion test by using a synthetic agar-based medium. With this modification, a higher efficacy and reproducibility of the results was obtained. A remarkable phenotypic diversity was observed and the lipid-dependent nature of M. pachydermatis was demonstrated by nutrient assimilation tests. Due to the condition of M. pachydermatis as an opportunistic pathogen, a real-time PCR was designed and validated to detect and quantify these yeasts from the external ear canal of dogs. Quantitative differences were determined in M. pachydermatis population in samples from healthy dogs and with otitis. Finally, phenotypic and genetic diversity of Malassezia furfur strains isolated from animals was studied. M. furfur is a species classically associated to human skin, although it has also been detected in different animals. In order to study its intraspecific variability, M. furfur strains were selected from different domestic animals and from wild birds held in captivity. On the one hand, a phylogenetic study was performed by sequencing two ribosomal regions and -tubulin gene. On the other hand, the same strains were analysed with phenotypic methods, including the modified Tween diffusion test. This study revealed a remarkable intraspecific variability, which could correspond to the adaptation of strains to different animal hosts. Also, the modified Tween diffusion test enabled the observation of more differences among strains than using the classical method. In the present study, we have demonstrated the presence of M. furfur in an ever broader spectrum of animal hosts