Nanoparticulas fotoativas para bio imagem ótica

Doutoramento em Nanociências e NanotecnologiaO objetivo principal desta dissertação foi o desenho, síntese e funcionalização de novos agentes para bio imagem baseados em nanopartículas. Devido à sua biocompatibilidade e facilidade de funcionalização da superfície, as nanopartículas têm sido amplamente utilizadas em aplicações biológicas. Aqui, apresentamos a aplicação de dois conjuntos de nanopartículas, nanopartículas de sílica (Si) e ouro (Au) como agentes de bio imagem em microscopia confocal de fluorescência e de raman, respetivamente. Nanopartículas fluorescentes do tipo “core-shell” foram preparadas através da metodologia de microemulsão inversa (intervalo de tamanhos 20 – 40 nm), com compostos à base de lantanídeos (Ln) (Ln = Europio III (EuIII) e Terbio III (TbIII) no interior (core) e Si como camada protetora. A funcionalização superficial das nanopartículas de Si foi conseguida através da química de silanos. Os Ln foram coordenados com compostos orgânicos como o ácido picolínico (picOH) ou com polioxometalatos (POM). A coordenação com o picOH trouxe ligeiras modificações no perfil fluorescente do metal, permitindo aos complexos Ln/picOH a sua excitação a comprimentos de onda de energia mais baixos. Este fenómeno é atribuído ao efeito de antena causado pelo ligando. Foram também realizados dois tipos diferentes de funcionalização, visando um especifico alvo. Cargas positivas foram usadas para direcionar para microorganismos (Candida albicans) e hidratos de carbono para células cancerígenas. As nanopartículas de Si fluorescentes com cargas positivas foram internalizadas pela C. albicans a sua distribuição visualizada através d e microscopia confocal de fluorescência. Foi possível observar a distribuição dessas nanopartículas no citoplasma celular sem internalização no núcleo. Em analogia, moléculas de hidrato de carbono (glucose e galactose) foram agrafadas à superfície de nanopartículas de Au de diferentes tamanhos (15, 30, 40 e 60 nm) e estudadas como possíveis nanomarcadores usando microscopia confocal de Raman como técnica ótica. Numa primeira abordagem, foram realizados estudos preliminares sobre a capacidade destas nanopartículas para produzir aumento da dispersão de superfície (SERS) bem como a sua biocompatibilidade nas células 9Lluc de glioma de rato. Os resultados mostraram os alongamentos característicos dos hidratos de carbono, para todas as nanopartículas de Au funcionalizadas como sinais SERS e, nenhuma citotoxicidade celular. Observou-se uma preferência para as nanopartículas de Au com 40 e 60 nm funcionalizadas com galactose. Além disso, a microscopia eletrónica de transmissão mostrou distribuição das nanopartículas em todo o citoplasma, mais especificamente dentro de organelos vesiculares, sem acumulação no núcleo. As nanopartículas de Au 60 nm funcionalizadas com galactose e glucose foram então estudadas em células cancerígenas, em tecidos tumorais e tumores sólidos como nanomarcadores, através da microscopia confocal de Raman. Estas nanoparticulas mostraram-se adequadas para serem usadas como nanomarcadores, conseguindo superar a autofluorescência proveniente dos tecidos biológicos. Além disso, um estudo de profundidade mostrou que seu sinal de SERS pode ser coletado em tumores sólidos até 2 mm de profundidade. Esta dissertação mostrou que nanopartículas podem ser utilizadas como marcadores alternativos aos fluoróforos comuns utilizados hoje em dia, apresentando biocompatibilidade e especificidade. Em relação às técnicas óticas utilizadas, a microscopia confocal de Raman mostrou ser uma alternativa vantajosa às mais comunsThe main goal of this dissertation was the design, synthesis and functionalization of new nanoparticles-based bio imaging agents. Due to their biocompatibility and ease surface functionalization, nanoparticles have been widely used in biological applications. Herein, we present the application of two sets of nanoparticles, silica (Si) and gold (Au) nanoparticles as bio imaging agents in confocal fluorescent and raman microscopy, respectively. Fluorescent core-shell Si nanoparticles were prepared through the reverse microemulsion methodology (size range 20 – 40 nm), with lanthanide (Ln)- based compounds [Ln = Europium III (EuIII) and Terbium III (TbIII)]) in the core and Si as protective shells. The surface functionalization of Si nanoparticles was achieved through silane chemistry. Ln were coordinated with organic compounds such as picolinic acid (picOH) or with polyoxometalates (POM). The coordination with the picOH brought slight modifications in the fluorescent profile of the metal ion, allowing for the Ln/picOH complexes their excitation at lower energy wavelengths. This phenomenon is attributed to the antenna effect caused by the ligand. Two different types of functionalization were also performed, aiming specific targeting. Positive charges were used to target microorganisms (Candida albicans) and carbohydrates to target cancer cells. Positive charged fluorescent Si nanoparticles were internalized by C. albicans and their distribution visualized through confocal fluorescent microscopy. It was possible to note the distribution of these nanoparticles at the cellular cytoplasm with no internalization in the nucleus. In analogy, carbohydrate moieties (glucose and galactose) were stapled in the surface of different sized Au nanoparticles (15, 30, 40 and 60 nm) and studied as possible nanoprobes using confocal Raman microscopy as optical technique. In a first approach, preliminary studies regarding to the ability of these nanoparticles produce surface enhanced resonance scattering (SERS) as well as their biocompatibility in rat 9Lluc glioma cells was studied. Results showed the characteristic carbohydrate stretches for the all the functionalized Au nanoparticles in solution as SERS signals, and no cellular cytotoxicity. Preference for the 40 and 60 nm Au nanoparticles functionalized with galactose was observed. Moreover, the transmission electron microscopy showed distribution by the nanoparticles throughout the cytoplasm more specifically within vesicular organelles, with no accumulation in the nucleus. The 60 nm galactose and glucose Au nanoparticles were then studied as nanoprobes in cancer cells, tumoral tissues and solid tumors. through confocal Raman microscopy. Theses nanoparticles showed to be suitable nanoprobes in these systems, being able to surpass the known autofluorescence coming from This dissertation showed that nanoparticles can be used as alternative probes to the common fluorophores nowadays used, presenting biocompatibility and specificity. Regarding to the optical techniques used, confocal Raman microscopy showed to be an advantageous alternative to the commonly used ones’