Implementação de técnicas analíticas de determinação de benzodiazepinas aplicadas à toxicologia forense

Mestrado em Métodos Instrumentais e Controlo de Qualidade AnalíticaO termo “forense” possui um duplo significado. No sentido comum, a ciência forense é entendida como uma disciplina científica particular (medicina, toxicologia, biologia ou química) aplicada às necessidades do direito civil ou criminal. Assim, um sinónimo óbvio de medicina forense é medicina legal. Numa abordagem mais ampla, poder-se-á dizer que todas as disciplinas “forenses” estão sujeitas – mais do que qualquer outra actividade científica – ao debate e ao controlo públicos. Os peritos forenses são obrigados a explicar o mais pequeno pormenor dos métodos utilizados, a fundamentar a escolha das técnicas analíticas aplicadas e a fornecer as suas conclusões imparciais, sob o olhar receoso e crítico dos servidores da justiça, bem como do público em geral, incluindo os media. O resultado final do trabalho dos cientistas forenses exerce influência directa sobre o destino de um determinado indivíduo ou grupo de indivíduos. Esta responsabilidade é o estímulo mais importante para os cientistas forenses, que determina os seus modos de pensar e de actuar. Com este trabalho espera-se contribuir para o esclarecimento judicial de casos relacionados com intoxicações causadas pelo consumo de benzodiazepinas, principalmente quando este conduz à ocorrência de acidentes com implicações judiciais e quando é efectuado em simultâneo com outras drogas (como é exemplo o etanol) que poderão potenciar o efeito tóxico das benzodiazepinas, que por si só possuem toxicidade limitada. Nesta tese, é apresentada, numa primeira fase, uma abordagem geral relativa aos fundamentos da toxicologia e da toxicologia forense, em termos de objectivos, campo de acção, implicações da toxicocinética das substâncias nas determinações analíticas, amostragem, procedimentos de extracção e instrumentação geral. Após a compreensão da arquitectura da toxicologia forense, passa-se à explanação destes conceitos gerais com aplicação específica às benzodiazepinas seguindo-se, então, a apresentação de duas técnicas analíticas para a determinação deste grupo de substâncias: a cromatografia gasosa com detecção por captura electrónica e por espectrometria de massa, com isolamento prévio dos analitos por processos de extracção em fase sólida. A implementação das duas técnicas analíticas acima descritas permite um melhor aproveitamento das capacidades técnicas existentes no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Porto do Instituto Nacional de Medicina Legal fornecendo, ao mesmo tempo, uma maior quantidade de informação relativa a cada processo, cuja importância é fundamental na eliminação de resultados anómalos. No que diz respeito aos processos de extracção, realizaram-se ensaios em amostras de urina com colunas Bond Elut Certify e em amostras de sangue com colunas Bond Elut Certify e Oasis HLB. No primeiro caso obtiveram-se resultados bastante satisfatórios com rendimentos de extracção superiores a 88%. No caso da extracção de amostras de sangue a eficiência das colunas Oasis HLB mostrou-se bastante superior à das Bond Elut Certify com a obtenção de rendimentos de extracção superiores a 81%, sendo este facto evidente relativamente ao lorazepam para o qual o valor de eficiência assume 10% através da extracção com Bond Elut Certify. Relativamente às técnicas cromatográficas estudadas, no que diz respeito à verificação da qualidade dos resultados, ambas as técnicas permitem a obtenção de coeficientes de variação inferiores aos considerados aceitáveis em ensaios cromatográficos (15%). A cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa possui aplicação limitada no caso da determinação do lorazepam, do clobazam e do flunitrazepam devido ao facto de fornecer limites de quantificação (9.0, 10.4 e 5.1 ppm, respectivamente) superiores aos valores indicados como tóxicos (superiores a 6, 4 e 3 ppm, respectivamente) e no caso do diazepam para o qual não foi possível a determinação de uma gama de trabalho que permitisse a linearidade da curva de calibração. Por sua vez, a técnica analítica por cromatografia gasosa com detecção por captura electrónica mostrou-se bastante robusta, com a verificação da linearidade de todas as curvas de calibração bem como com a obtenção de limites de detecção e de quantificação aceitáveis (inferiores a 2.7 e 8.2 ppm, respectivamente), permitindo a sua aplicação na determinação de todos os compostos benzodiazepínicos estudados até valores terapêuticos.The term “forensic” has a double meaning. In the most common sense, forensic science is understood as a particular scientific discipline (medicine, toxicology, biology or chemistry) that is applied for the needs of civil or criminal law. Therefore, an obvious synonym of forensic medicine is legal medicine. In a more wide and deeper sense, all “forensic” disciplines are – more than any other scientific activities – under public debate and control. Forensic experts have tho justify the smallest details of the methods used, to substantiate the choice of the applied technique and to afford their unbiased conclusions, all under the critical and often mistrustful look of the servants of Justice, as well as the general public, including the media. The final result of the forensic scientists activity exerts a direct influence on the fate of a given individual. This responsibility is the driving force, which determines the way of thinking and acting in forensic sciences. This work intends to contribute to the resolution of legal cases related to benzodiazepines consumption, mainly in accidents with legal consequences, and when these compounds are consumed with other drugs (such as ethanol), which, enhance their toxic effect, usually limited. In the first part of this thesis, a general approach is presented in terms of toxicology and forensic toxicology fundamentals such as: aims, field of action, toxicokinetics implications in analytica determinations, sampling, extraction procedures and instrumental methods. After the comprehension of forensic toxicological architecture, this information is linked to specific applications to benzodiazepines and two analytical techniques for benzodiazepines analysis are introduced: gas chromatography with electron capture detector and gas chromatography coupled with mass spectrometry, with previous isolation of the compounds by solid phase extraction. The implementation of the above mentioned methodology in the INML-DP Forensic Toxicology Service allows a rational use of the available techniques, producing relevant analytical data. As extraction procedures are concerned, one have prepared urine assays using solid phase Bond Elut Certify extraction columns and blood assays using solid phase Bond Elut Certify and Oasis HLB extraction columns. In the first case satisfactory results with extraction efficiencies above 88% were obtained. In blood samples, Oasis HLB extraction columns have shown bette efficiency than Bond Elut Certify extraction columns, with extraction efficiencies above 81%. This fact was better proved with lorazepam, which indicated an extraction efficiency of 10% by using Bond Elut Certify extraction columns. The results have shown that the variation coefficients in both chromatographic techniques were well below 15%, the maximum acceptable value in chromatography. Due to high quantification levels obtained for lorazepam, clobazam and flunitrazepam (9.0, 10.4 and 5.1 ppm, respectively), above toxic values (6, 4 and 3 ppm, respectively), and the lack of linearity in calibration curve of diazepam, the application of GC/MS technique is limited. GC/ECD exhibited solid and reproducible results in all the studied benzodiazepines, even for therapeutic levels, with comproved linearity in all calibration curves and reasonable detection and quantification limits (2.7 and 8.2 ppm, respectively)