Caracterização molecular de estirpes de Aeromonas spp. resistentes a antibióticos beta-lactâmicos

Mestrado em Microbiologia MolecularEstudos feitos em todo o mundo têm demonstrado que Aeromonas spp. estão distribuídas universalmente e podem ser isoladas de amostras clínicas, alimentares e ambientais. São exemplo de microrganismos patogénicos emergentes. Em sistemas de aquacultura, as infecções bacterianas são a causa principal das quebras de produtividade. O uso intensivo de antibióticos beta-lactâmicos como agentes terapêuticos levou ao aparecimento de estirpes multiresistentes. Neste trabalho, foram analisadas estirpes de Aeromonas isoladas de amostras de tecido da pele e rins de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) de uma aquacultura da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Foram incluídas também estirpes de referência. Os testes de susceptibilidade a antibióticos beta-lactâmicos revelaram que a maior parte dos isolados é resistente a penicilinas e cefalosporinas de 1ª geração. Em 7 isolados foi detectada resistência a carbapenemos (imipenemo). Por forma a caracterizar o mecanismo de resistência dos isolados resistentes ao imipenemo, foram desenhados "primers" para amplificar por PCR genes de resistência homólogos a cphA e/ou imiS, que codificam as metalo-beta-lactamases CphA e ImiS, já descritas em Aeromonas spp.. Em 5 dos isolados e em 2 estirpes referência, foi possível amplificar por PCR, com os "primers" desenhados, Aer- R e Aer-F, um fragmento com o tamanho esperado, cerca de 670 pb, a partir do DNA total das estirpes de Aeromonas spp.. A análise das sequências nucleotídicas e das sequências de aminoácidos deduzidas revelou tratarem-se de fragmentos de DNA de genes homólogos a cphA/imiS, que codificam para metalo-beta-lactamases de classe B, subclasse B2. Procedeu-se também à detecção de sequências homólogas por hibridação DNA-DNA, usando uma sonda marcada por PCR com os "primers" Aer-R e Aer-F. Ocorreu hibridação entre o fragmento de DNA usado como sonda e o DNA de todos os isolados que apresentavam actividade de carbapenemase. Pretendeu-se, também, caracterizar os isolados ao nível molecular, através de técnicas de tipagem genética como ARDRA e rep-PCR. Os perfis ARDRA obtidos por digestão com MboI e AluI permitiram identificar os isolados como Aeromonas bestiarum Aeromonas hydrophila e Aeromonas media. Os perfis REP- e BOX-PCR resultantes mostraram-se mais complexos que os perfis ARDRA e permitiram avaliar o grau de diversidade genómica dos isolados, mostrando-se úteis na tipagem genética de isolados deste grupo de procariotas.Worldwide studies have demonstrated that Aeromonas spp. are universally distributed and widely isolated from clinical, environmental and food samples. They are an example of emerging bacterial pathogens. In aquaculture explorations, bacterial infectious diseases are the major cause of decreases in productivity. The extensive use of beta-lactam antibiotics as therapeutic agents has generated multiresistant strains. In this work, tissue samples from the skin and kidney of rainbow trouts (Oncorhynchus mykiss) from a fish farm at the Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro were examined for the presence of Aeromonas spp. Reference strains were also included in this study. The susceptibility to antibiotics tests revealed that most of these strains are resistant to penicillins and 1st generation cephalosporins. It was detected resistance to carbapenems (imipenem) in 7 aeromonads. In order to understand the resistance mechanism of the strains that showed resistance to carbapenems, primers Aer-R and Aer-F were designed to detect by PCR, homologous genes to cphA/imiS, which code for the metallo-beta-lactamases CphA and ImiS, already described in Aeromonas spp. In 5 isolates and in 2 reference strains, it was possible to amplify by PCR a DNA fragment with 670 bp as expected, whose sequence was determined. The nucleotide and deduced amino acid sequence analysis revealed that these are DNA fragments homologous to cphA/imiS, that code for class B, subclass B2 metallo-betalactamases. DNA-DNA hybridization was also applied using a DNA fragment, amplified by PCR with primers Aer-R and Aer-F, as probe. There was hybridization between the probe and the DNA from all the strains that showed resistance to carbapenems. Aeromonads isolates were also compared using different molecular typing techniques like ARDRA and rep-PCR. ARDRA profiles obtained from enzymatic digestion of rDNA 16S wilth MboI and AluI, allowed the identification of strains as Aeromonas bestiarum, Aeromonas hydrophila and Aeromonas media. Fingerprinting by REP- and BOX- PCR provided complex genomic profiles, proving that these are good methods for typing aeromonads