Estudio de los factores moleculares en juego en la evolución de las enzimas metalo‐β‐lactamasas

Los compuestos β‐lactámicos constituyen uno de los grupos de antibióticos más empleados para el tratamiento de infecciones bacterianas. Al poco tiempo de su introducción, se puso de manifiesto la presencia de mecanismos de resistencia por parte de las bacterias, las cuales evolucionan rápidamente ante la presión de selección impuesta por el uso indiscriminado de dichos compuestos. Dentro de los antibióticos β‐lactámicos, las penicilinas y las cefalosporinas de primera generación son los más utilizados comúnmente, mientras que las cefalosporinas de tercera y cuarta generación y los carbapenemes se reservan para infecciones graves mediadas por cepas multirresistentes. Las metalo‐β‐lactamasas (MBLs) constituyen uno de los mecanismos de resistencia más alarmantes diseminado en los últimos años, debido a su capacidad de hidrolizar tanto penicilinas como cefalosporinas y carbapenemes, dejando escasas alternativas para el tratamiento. A esto se suma que no se cuenta al presente con un inhibidor de uso clínico capaz de inactivarlas. En este contexto, nos propusimos explorar los mecanismos que afectan a nivel molecular la capacidad de conferir resistencia de estas enzimas, y por lo tanto, su evolución. Para ello empleamos como modelo de estudio la enzima BcII de Bacillus cereus. Esta enzima, si bien corresponde a un organismo no patógeno, ha sido extensamente empleada como representante de las MBLs de subclase B1, que incluye las enzimas de más impacto clínico, como las IMPs, VIMs y NDMs. Las MBLs pertenecen a una superfamilia de enzimas, mayormente de actividad hidrolasa, dependientes de la unión de metales divalentes en su sitio activo. En el caso de las MBLs, presentan el potencial de unir dos iones Zn(II) en su sitio activo. Un tema de discusión central en el mecanismo de hidrólisis de las MBLs de subclase B1 ha sido la identidad de la especie activa relevante, pudiendo ser alguna de la especies mono‐Zn(II) o la especie di‐Zn(II). Las enzimas de la superfamilia comparten un plegamiento global similar a pesar de una baja homología de secuencia. Los residuos que conforman el sitio activo actuando como constituyen las regiones de mayor conservación de secuencia. Una particularidad de las enzimas B1 es que presentan como ligando de Zn(II) un residuo de Cys en lugar de un residuo de Asp altamente conservado en la superfamilia en la posición 221. En el presente trabajo se estudió la mutante BcII‐C221D. Esta variante, si bien presenta una actividad análoga a la enzima silvestre, no es capaz de conferir niveles de resistencia comparables. Observamos que esto se debe a una disminución en la afinidad por Zn(II) de uno los sitios de unión. Concluimos que el residuo de Cys en dicha posición es necesario para asegurar la unión de Zn(II). A su vez, esta mutante da cuenta de la necesidad de forma dar la especie di‐Zn(II) en el periplasma, donde debe ensamblarse para conferir resistencia, lo cual demuestra que es la especie relevante in vivo. Por otro lado, trabajamos con una variante de BcII obtenida previamente mediante evolución molecular dirigida contra el antibiótico cefalexina. Esta variante, a la cual denominamos GLVN presenta cuatro mutaciones (G262S, L250S, V112A y N70S) y es capaz de conferir niveles elevados de resistencia para cefalexina a células de Escherichia coli, en contraste a la enzima silvestre. Con el propósito de estudiar los caminos evolutivos posibles desde la enzima silvestre hasta la cuádruple mutante, se construyeron las 16 combinaciones posibles de estas cuatro mutaciones. Se evaluó la capacidad de conferir resistencia a través de concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs), lo cual nos da una medida de la denominada aptitud a nivel organismo, evaluada sobre las células bacterianas. De esta manera, observamos que sólo aquellas combinaciones que presentan la mutación G262S son capaces de aumentar los niveles de resistencia contra cefalexina. Las mutaciones V112A y N70S presentan epistasis positiva con G262S, dado que producen efectos beneficiosos para la resistencia en el contexto de G262S, mientras que en el contexto silvestre son, respectivamente, neutral y deletérea. Estas cuestiones condicionan los caminos posibles hacia el óptimo GLVN, siendo accesibles para la evolución adaptativa aquellos en los cuales la mutación G262S aparece en los pasos iniciales. Luego, para analizar los factores moleculares que definen la aptitud para las MBLs, nos planteamos caracterizar en mayor profundidad aquellas variantes que contienen la sustitución G262S. Observamos que esta mutación produce un incremento marcado en la eficiencia hidrolítica de la enzima frente a cefalexina, en forma concomitante al aumento de CIM. Sin embargo, la suma de las demás sustituciones no produce aumentos en la actividad. Encontramos que medidas de actividad realizadas con extractos periplasmáticos muestran una mejor correlación que aquellos realizados con enzimas puras, evidenciando que el estado de la proteína en el periplasma puede ser responsable de las diferencias en la CIMs. Queda en evidencia que existen otras propiedades moleculares, además de la eficiencia hidrolítica in vitro, que están siendo afectadas por estas mutaciones y que contribuyen a la aptitud. Es de esperar que la estabilidad y la capacidad de captar Zn(II) de estas enzimas afecte la cantidad de enzima activa en el periplasma, por lo que se prosiguió con el análisis de estos factores. Se realizaron medidas de la estabilidad térmica en extractos periplasmáticos, y de esta manera se encontró que la mutación G262S produce una disminución en la estabilidad con respecto a la enzima silvestre. La mutación V112A ejerce un efecto compensatorio, aumentando la estabilidad en el contexto de G262S. De igual manera, se observa un efecto estabilizador sobre la triple mutante que contiene las mutaciones G262S/L250S/N70S. Estos aumentos de estabilidad están acompañados de aumentos de CIMs en ambos casos. Sin embargo, la estabilidad por sí sola no alcanza para explicar los aumentos en CIMs observados en los demás casos. Para evaluar la contribución de la capacidad de captar Zn(II) se realizaron medidas de CIMs en condiciones de disponibilidad de Zn(II) variable. Se observó que los valores de CIMs conferidos por la mutante simple G262S presentan una marcada dependencia con la cantidad de Zn(II) en el medio. Esta dependencia disminuye al sumarse cualquiera de las otras tres mutaciones. La variante GLVN, en cambio, es insensible a las condiciones de Zn(II) en el medio. Mediante ensayos de afinidad in vitro comprobamos que la mutación G262S disminuye la afinidad por Zn(II) respecto a la enzima silvestre, y que la mutación N70S compensa esta pérdida restaurando la afinidad a valores cercanos a los de la enzima silvestre. Evaluando globalmente la contribución de los distintos factores a la capacidad de conferir resistencia de estas MBLs, observamos que ante eficiencias hidrolíticas similares, la capacidad de captar Zn(II) es el factor de mayor peso. Las MBLs captan el Zn(II) en el periplasma bacteriano, donde existe una alta competencia por dicho metal, y cuya disponibilidad depende del medio. Durante el proceso infectivo, los mamíferos producen como mecanismo de defensa la proteína calprotectina, que secuestra Zn(II). Es decir, que en el ambiente donde deben actuar las MBLs para la sobrevida de la bacteria, la disponibilidad de Zn(II) se encuentra limitada. Es razonable entonces que la evolución de las MBLs no curse sólo a través de aumentos en la eficiencia hidrolítica, sino que debe ir acompañado de un ajuste en la capacidad de captar Zn(II). Dada la dificultad de diseñar un inhibidor de uso clínico basado en el mecanismo de las MBLs, cabe resaltar que la contribución de la capacidad de unir Zn(II) a la aptitud invita a pensar en nuevas estrategias de inhibición.Fil: Meini, María Rocío. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina