Regulación del metabolismo lipídico en Streptomyces coelicolor

Streptomyces es un género bacteriano caracterizado por poseer un complejo ciclo de vida que involucra varios pasos de diferenciación fisiológica y morfológica. Durante su desarrollo, las bacterias de este género suelen producir una amplia gama de metabolitos con actividad biológica, que han sido tradicionalmente utilizados como antibióticos, antiparasitarios, antifúngicos, anticancerígenos, entre otros. Sin embargo, los Streptomyces son capaces también de sintetizar y acumular triglicéridos (TAG) como reserva de energía y carbono. Esta característica, si bien es inusual en bacterias, es compartida con otros géneros del orden de los Actinomicetales como Rhodoccocus, Nocardia y Mycobacterium. A pesar de su diversificado metabolismo lipídico, los estudios en el género Streptomyces se han concentrado generalmente en el área de la producción de metabolitos secundarios, y muy poco se conoce acerca de cómo este organismo sintetiza sus ácidos grasos y regula su flujo hacia fosfolípidos o TAG. Además, en S. coelicolor la síntesis de ácidos grasos y del metabolito secundario actinorrodina comparten un precursor clave, el malonil-CoA, lo que plantea un complejo escenario regulatorio para la síntesis de estos compuestos carbonados en este microorganismo. Así, como objetivo general de este trabajo de tesis nos propusimos identificar y caracterizar los mecanismos genéticos y bioquímicos que regulan la síntesis de ácidos grasos y lípidos de reserva en Streptomyces coelicolor. Para ello, en una primera etapa nos centramos en la caracterización de un regulador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos en esta bacteria, FasR, con el fin de develar su rol fisiológico y entender de qué manera lleva a cabo su función regulatoria. Demostramos, mediante experimentos genéticos y bioquímicos, que FasR es un activador transcripcional del operón fab (fabD-fabH-acpP-fabF), el cual codifica para las proteínas esenciales del sistema de sintasa de ácidos grasos de tipo II de este organismo. FasR lleva a cabo su función uniéndose directamente a la región corriente arriba del operón fab, y su actividad estaría modulada por algún metabolito relacionado con el metabolismo de lípidos. A continuación nos planteamos identificar el paso enzimático que genera el diacilglicerol (DAG), un sustrato clave para la síntesis de TAG. A pesar del rol que juegan estas moléculas en las diferentes especies como reserva de energía y carbono, la ruta de abastecimiento de DAG para su síntesis es completamente desconocida en bacterias. En este apartado trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas fosfatidato fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían las responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el DAG necesario para la síntesis de TAG. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar tres probables proteínas con actividad PAP. El posterior estudio de las mismas reveló que sólo dos de ellas, Lppα y Lppβ, eran capaces de defosforilar fosfatidato in vitro y tenían además un rol en el metabolismo lipídico de S. coelicolor. Una cepa mutante en ambos genes presentó niveles reducidos de TAG a tiempos cortos de crecimiento, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a tiempos mayores. Estas evidencias indican que si bien tanto Lppα como Lppβ estarían proveyendo DAG para la síntesis de TAG en S. coelicolor, existen en este organismo rutas alternativas de generación de DAG que prevalecen a tiempos largos de cultivo. Por último, con la información obtenida a partir de estos estudios básicos se reconstituyó la vía de síntesis de TAG en la bacteria no oleaginosa E. coli como prueba de concepto acerca de la funcionalidad de los genes caracterizados en la vía de síntesis de TAG en S. coelicolor. Para ello se utilizó como hospedador una cepa de E. coli ΔdgkA, que posee una deleción en el gen que codifica para una DAG quinasa capaz de reciclar el DAG hacia la síntesis de fosfolípidos. En este contexto se expresaron en forma heteróloga las enzimas fosfatidato fosfatasa Lppβ y DAG aciltransferasa Sco0958, que catalizan los dos últimos pasos de la síntesis de TAG. Si bien la sola expresión de Sco0958 demostró ser suficiente para la síntesis de TAG en este contexto genético, la expresión adicional de la fosfatasa Lppβ tuvo un efecto positivo en el contenido de TAG, confirmando su capacidad de generar el sustrato DAG limitante para la síntesis de TAG. Luego de una optimización de la cepa de E. coli productora de TAG, y de su cultivo en sistemas de alta densidad, fuimos capaces de obtener una producción de 722,1 mg TAG/L, lo que constituye el mayor título de TAG reportado para E. coli recombinantes en la literatura. En conjunto, estos resultados muestran cómo las evidencias que surgen a partir de estudios básicos pueden volcarse en el campo aplicado para resolver una necesidad particular. Sin embargo, a pesar de lograr el mayor título de TAG reportado hasta el momento para E. coli, es necesario aún incrementar la productividad volumétrica de TAG en este sistema para lograr el establecimiento de este huésped heterólogo como futura plataforma de biosíntesis de lípidos neutros aptos para la producción de, por ejemplo, biocombustibles.Fil: Comba, Santiago. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina