A influência do plasma humano na formação de biofilme e virulência de Staphylococcus epidermidis

Dissertação de mestrado em BiotecnologiaStaphylococcus epidermidis é um colonizador comensal da pele e mucosas humanas, que devido à sua capacidade para formar biofilmes em superfícies abióticas, é considerado um dos principais agentes causadores de infeções associadas ao uso de dispositivos médicos invasivos. Nos últimos anos, a virulência desta espécie tem sido extensamente estudada. Porém, a maioria destes estudos foram realizados in vitro, utilizando meios ricos e na ausência de fatores do hospedeiro, e, por isso, em condições muito diferentes do ambiente in vivo. Assim, o principal objetivo desta dissertação foi o estudo da influência do plasma humano no crescimento de S. epidermidis, de forma a melhor simular as condições in vivo. Dessa forma, foi avaliado o efeito de diferentes percentagens de plasma no crescimento planctónico, capacidade de formação de biofilme, estrutura do biofilme, cultivabilidade e viabilidade das células dos biofilmes, suscetibilidade aos antibióticos e alteração da expressão dos genes de virulência. Neste estudo não foram usadas concentrações de plasma acima dos 20% devido ao efeito inibitório que o nosso plasma comercial mono-dador apresentou. Apesar disso, é de salientar que 20% de plasma foi o suficiente para alterar significativamente o efeito da tolerância a certos antibióticos, reduzindo o efeito da vancomicina e tetraciclina e potenciando o efeito da rifampicina. Aparentemente, o plasma ligou-se às moléculas de tetraciclina, diminuindo a sua disponibilidade e, consequentemente, interferindo com a sua eficácia. Curiosamente, diferentes resultados foram obtidos utilizando meios de cultura de diferentes marcas, bem como diferentes concentrações iniciais de células. As imagens obtidas por CLSM conjugadas com uma avaliação macroscópica dos biofilmes, permitiram inferir que o plasma interferiu com a interação entre as células, diminuindo a coesão dos biofilmes formados na sua presença. Por fim, verificou-se uma tendência de redução da expressão dos genes icaA, dltA e sepA, associados à proteção da bactéria contra fatores imunitários, assim como do gene srdG, envolvido na adesão a proteínas humanas, na presença de plasma. Concluindo, os nossos resultados destacam a importância da inclusão de fatores do hospedeiro nos ensaios in vitro, a fim de mimetizar as condições in vivo, e, por conseguinte, aumentar o significado clínico dos resultados obtidos.Staphylococcus epidermidis, a commensal colonizer of healthy human skin and mucosae, is one of the most common etiological agents of medical device-related infections. Hence, several efforts have been made to identify S. epidermidis virulence determinants. However, the great majority of these studies were performed using artificial rich media, in the absence of host factors, which composition does not reflect in vivo environment. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the influence of human plasma on S. epidermidis virulence by including host factors in the in vitro model used to better mimic in vivo conditions. For this, it was assessed the effect of different plasma concentrations on planktonic growth, biofilm formation capacity, biofilm structure, biofilm cells culturability and viability, susceptibility to antibiotics and alteration of virulence gene expression. Due to the inhibitory effect that our commercial plasma from a single donor presented, plasma concentrations above 20% were not used in this study. Despite this, it should be noted that 20% of plasma was enough to significantly alter the tolerance effect to some antibiotics, reducing the effect of vancomycin and tetracycline and enhancing the effect of rifampicin. Apparently, plasma bound to tetracycline molecules, decreasing their availability and, therefore, interfering with their efficacy. Interestingly, different results were obtained using culture media from different brands, as well as different initial cells concentrations. CLSM data combined with a macroscopic assessment of biofilms showed that human plasma interfered with intracellular bonds, leading to the formation of poorly cohesive biofilms. Finally, there was a trend of decreased expression of icaA, dltA and sepA genes, associated with bacteria protection against immune factors, and srdG gene, involved in the adhesion to human proteins, in the presence of plasma. Overall, our results highlight the importance of introducing host factors in in vitro assays in order to better mimic in vivo conditions consequently increasing the clinical relevance of the results obtained.O trabalho apresentado nesta tese foi apoiado pela Fundação Portuguesa para a Ciência e Tecnologia (FCT) no âmbito do financiamento estratégico da unidade UID/BIO/04469/2013, COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684) e operação BioTecNorte (NORTE-01-0145-FEDER-000004) financiada pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Norte 2020 - Programa Operacional Regional do Norte