Roturas massivas da coifa dos rotadores: uma abordagem biológica e regenerativa

Tese de Doutoramento em MedicinaMassive rotator cuff tears (MRCTs) are very large tears that are difficult to repair and often associated to an uncertain prognosis. These lesions are usually degenerative and may be associated with chronic pain and severe functional impairments. They are extremely frequent with advancing age, leading to great suffering and limitations in affected patients. The musculo-tendinous degenerative changes associated to chronic MRCTs and, the low natural healing and regeneration potential of the rotator cuff Tendon-Bone interface (TBi) represents a difficult challenge, thereby imposing the development of new therapeutic strategies. Several clinical solutions (e.g. surgical repair, tendon transfers, reverse shoulder arthroplasty and, superior capsule reconstruction) have been addressed to tackle this problem. However, none of them have been, so far, satisfactory, imposing the need for innovative therapeutical approaches. Several studies have proposed the use of stem cells as a possible tool for tendon healing and regeneration, and within it, human mesenchymal stem cells (hMSCs) have emerged as a valid therapeutic option. Most of their therapeutic effects are attributed to their capacity of secreting a wide panel of trophic factors (secretome) capable of inducing modulation and regenerative processes in the affected regions. Having this in mind the present thesis aimed at developing innovative strategies for MRCT regenerative medicine based on hMSCs, their secretome and the combination of them with nanopatterned based biodegradable biomaterials. For this purpose a MRCT rat model was initially established by sectioning bilaterally the supraspinatus and infraspinatus tendons. Interestingly, with the use of a bilateral lesion, our results demonstrated that the degenerative changes were aggravated in a more accurate way, resembling those observed in human tissues. Consequently, the described animal model represented a key step for the assessment of therapeutic strategies aiming at preventing/reverting chronic musculo-tendinous changes and/or enhancing the potential healing of TBi. After this, considering the importance of muscle quality on TBi healing and surgical outcomes when repair is attempted, the effect of hMSCs secretome on the prevention of muscle degeneration after inflicting a MRCT was analyzed. It was observed that the injection of hMSCs secretome immediately after the lesion was established, could decrease the development of muscle degeneration in a rodent model of MRCT. In addition, both precise intramuscular local injection and multiple systemic secretome injections shown to be promising delivery forms for preventing muscle degeneration. This strategy is particularly important for patients whose tendon healing after later surgical repair could be compromised by the progressing degenerative changes. Finally, the impact of a Tissue Engineering (TE) strategy based on the combination of an electrospun keratin scaffold seeded with hMSCs secretome-preconditioned human tendon cells (hTCs) to improve rotator cuff TBi healing, without surgical repair, was assessed. Initial in vitro data revealed that hMSCs secretome increased hTCs phenotype, particularly the expression of extracellular matrix associated molecules, as well as their cell densities, and viability. A proteomic characterization of hMSCs secretome, revealed the presence of specific proteins (e.g. Follistatin, Pigment epithelium-derived factor (PEDF), IL-6, decorin, and biglycan) involved in muscle homeostasis and TBi healing, which are most likely linked to these phenomena. Subsequent experiments performed in a MRCT rat animal model (previously described and discussed) revealed that preconditioning hTCs with the hMSCs secretome in a TE strategy yielded improved rotator cuff TBi healing. In summary, the present work indicates that hMSCs, and their secretome, could represent a potential tool to help treating and improve MRCT outcomes. Nevertheless, we should keep in mind that its application in the future should be combined with other different approaches, particularly those that use TE concepts. These findings are of clinical and social relevance as they bring a new perspective for the prevention and treatment of MRCT aiming to improve the quality of life of these patients.As roturas massivas da coifa dos rotadores (RMCR) são roturas grandes, difíceis de reparar e muitas vezes associadas a um prognóstico incerto. Estas lesões são geralmente degenerativas e podem causar dor crónica e incapacidade funcional graves. As RMCR são mais frequentes com o avançar da idade, levando a um aumento da sintomatologia e limitação funcional. As alterações degenerativas músculo-tendinosas associadas às RMCR crónicas e o baixo potencial natural de cicatrização e regeneração da interface Osso-Tendão (iOT) da coifa dos rotadores representam um desafio difícil, impondo assim o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Várias soluções clínicas (e.g. reparação cirúrgica, transferências tendinosas, artroplastia invertida do ombro e reconstrução da cápsula superior) têm sido usadas para tentar resolver este problema. No entanto, nenhuma destas opções tem sido satisfatória, até agora, impondo a necessidade de terapêuticas inovadoras. Vários estudos têm proposto o uso de células-estaminais como uma possível ferramenta para a cicatrização e regeneração do tendão e, dentro destas, as células-estaminais mesenquimatosas humanas (CEMh) emergiram como uma opção terapêutica válida. A maior parte dos seus efeitos terapêuticos é atribuída à sua capacidade de segregar um vasto painel de fatores tróficos (secretoma) que são capazes de induzir modulação e processos regenerativos nas regiões afetadas. Tendo isto em mente, a presente tese teve como objetivos o desenvolvimento de estratégias inovadoras para a medicina regenerativa das RMCR baseada em CEMh, o seu secretoma e a combinação deles com biomateriais biodegradáveis baseados em nanopartículas. Para este propósito, um modelo de rato de RMCR foi inicialmente estabelecido através da secção bilateral dos tendões supra-espinhoso e infra-espinhoso. Curiosamente, os nossos resultados demonstraram que usando a lesão bilateral, as alterações degenerativas foram agravadas de forma mais consistente e semelhante aquelas observadas nos tecidos humanos. Consequentemente, o modelo animal descrito representou um passo chave para a avaliação de estratégias terapêuticas visando a prevenção/reversão de alterações músculo-tendinosas crónicas e/ou o aumento do potencial de cicatrização da iOT. Depois disso, e considerando a importância da qualidade do músculo na cicatrização da iOT e dos resultados cirúrgicos quando a reparação é tentada, foi analisado o efeito do secretoma das CEMh sobre a prevenção de degeneração muscular após induzir uma RMCR. Os resultados demonstraram que a injeção de secretoma das CEMh, imediatamente após a lesão ser estabelecida, poderia diminuir o desenvolvimento de degeneração muscular num modelo de rato de RMCR. Além disso, tanto a injeção local precisa intramuscular quanto as injeções sistémicas múltiplas de secretoma mostraram ser formas de administração promissoras para prevenir a degeneração muscular. Esta estratégia é particularmente importante para os pacientes cuja cicatrização do tendão após a posterior reparação cirúrgica poderia ser comprometida pelas alterações degenerativas progressivas. Por fim, avaliou-se o impacto de uma estratégia de Engenharia de Tecidos (ET) baseada na combinação de uma matriz de queratina electroalinhada semeada com células tendinosas humanas (CTh) pré-condicionadas pelo secretoma das CEMh para melhorar a cicatrização da iOT da coifa dos rotadores, sem reparação cirúrgica associada. Os dados iniciais in vitro revelaram que o secretoma das CEMh aumentaram o fenótipo das CTh, particularmente a expressão de moléculas associadas à matriz extracelular, bem como a sua viabilidade e densidades celulares. A caracterização proteómica do secretoma das CEMh, revelou a presença de proteínas específicas (e.g. Follistatina, fator derivado do epitélio pigmentado (FDEP); IL-6, decorina, and biglycano) envolvidos na homeostasia muscular e cicatrização da iOT, e que estão muito provavelmente ligados a estas ações. Experiências subsequentes realizadas no modelo animal de rato de RMCR (anteriormente descrito e discutido) revelaram que o pré-condicionamento de CTh com o secretoma das CEMh, numa estratégia de ET, proporcionou uma melhoria da cicatrização da iOT da coifa dos rotadores. Em resumo, o presente trabalho indica que as CEMh, e o seu secretoma, podem representar um instrumento potencial para ajudar a tratar e melhorar os resultados clínicos das RMCR. No entanto, devemos ter em mente que a sua aplicação futura deve ser combinada com outras abordagens diferentes, particularmente aquelas que utilizam conceitos de ET. Estes achados são de relevância clínica e social, uma vez que trazem uma nova perspetiva para a prevenção e tratamento das RMCR visando melhorar a qualidade de vida desses pacientes.The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), Minho University. Financial support was provided by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology under the project POCI-01-0145-FEDER-007038; and by the project NORTE-01-0145-FEDER- 000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF)