Plattformtechnologien für die automatisierte Bioprozessentwicklung

The development of production processes in biotechnology is a time and resource intensive task due to the vast design space to be screened. Therefore, processes are commonly performed at a local optimum. Within the past two decades, miniaturization, parallelization and automation of laboratory work have improved significantly and researchers are now able to carry out thousands of experiments per week in automated facilities. In many cases there is a disagreement between the results of small-scale experiments and data from the production scale due to the different conditions, in which the cells are cultivated. Laboratory scale experiments are often performed as batch cultures in complex media without any instrumentation, while the production processes run under fed-batch conditions in instrumented bioreactors. This discrepancy may result in multiple rounds of experiments, until a feasible strain for scale-up is identified. Therefore, cultivation conditions should be kept consistent throughout the developmental line. In this work, platform technologies for consistent bioprocess development are presented in the form of three publications. First, a novel dissolved oxygen sensor for screening facilities was developed, which can determine the aeration level of cultures grown in 96-well plates that are transported from the incubator to the plate reader. The long response time (t90) of 9.7 min allows an estimation of the oxygenation status during incubation. The sensor detected oxygen limitation in fed-batch cultures of E. coli and S. cerevisiae. In the second part, a workflow for rapid cell lysis buffer optimization using design of experiments (DoE) is presented. Experiments were planned with a DoE software and written as worklists for the liquid handling robot into a laboratory information management system (infoteam iLab-Bio). In three experimental runs, a lysis buffer composition for efficient release of beta-galactosidase from E. coli was determined. The product formation profile of yeast strains was evaluated using parallel fed-batch cultures at the millilitre-scale in the third part. For comparison, A-stat cultivations in a 1.5 L bioreactor were performed, which showed comparable product formation rates. Using these platform technologies, a framework for streamlined experimental planning, execution and data management can be established.Die Entwicklung von Produktionsprozessen in der Biotechnologie ist zeit- und kostenintensiv, insbesondere bei der Produktion von therapeutischen Proteinen und gentechnisch verbesserten Enzymen. Neben allgemeinen Prozessgrößen wie Temperatur, pH und Medienzusammensetzung beeinflussen Produktionsstamm, Expressionssystem und Fusionspartner sowie Prozessführung und die Aufarbeitung des Produktes den Ertrag und damit die Wirtschaftlichkeit eines biotechnologischen Herstellungsprozesses. Die Anzahl an nötigen Laborexperimenten zur Optimierung ist meist zu groß, um manuell durchgeführt zu werden, sodass häufig nur bei einem Quasi-Optimum gearbeitet werden kann. In den letzten zwei Jahrzehnten ist die Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung von Experimenten stark vorangeschritten, sodass heute tausende von Versuchen pro Woche durchgeführt werden können. Ob die Daten aus den kleinen Systemen prädiktiv für den Produktionsmaßstab eingesetzt werden können, ist jedoch nicht ohne Zweifel. Daher müssen für die Maßstabsvergrößerung in der Regel zusätzliche Versuchsreihen in Labor- und Pilotbioreaktoren durchgeführt werden. Die Unterschiede zwischen Labor- und Produktionsbedingungen betreffen häufig die Kulturführung und die eingesetzten Medien. Meist wird ein Batch-Prozess mit Komplexmedium im Kleinmaßstab und ein Fed-Batch Prozess mit Mineralsalzmedium in der Produktion eingesetzt. Außerdem erlauben die Screening-Systeme nur Endpunktmessungen und es wird häufig erfahrungsbasiert oder nach Versuch und Irrtum gearbeitet. Die Datenaufzeichnung und -Auswertung geschieht meist manuell. Um die Aussagekraft von Laborexperimenten im Kleinmaßstab zu verbessern, sollten Versuchsbedingungen gewählt werden, die dem Produktionsmaßstab entsprechen. Diese Prozessentwicklungsstrategie wird auch konsistente Bioprozessentwicklung genannt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Plattformtechnologien für konsistente Bioprozessentwicklung erarbeitet und in Form von drei Fallstudien auf unterschiedliche Fragestellungen angewendet. Ein neuartiger Sensor zur Messung von Gelöstsauerstoff in Mikrowellplatten wurde in der ersten Publikation entwickelt. Der Sensor besitzt eine Ansprechzeit von 9,7 Minuten, was die verlässliche Bestimmung von Gelöstsauerstoffwerten in Anlagen ermöglicht, in denen Verzögerungen durch Transportzeiten vom Inkubator zum Photometer vorhanden sind. Mithilfe von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae Kulturen konnte demonstriert werden, dass der Sensor Sauerstofflimitationen im Inkubator detektieren kann. In Kombination mit einem schnell ansprechenden Sensor ist eine umfassende Charakterisierung des automatisierten Kultivierungssystems möglich. In der zweiten Publikation wurde ein Arbeitsablauf zur schnellen Optimierung des chemisch-enzymatischen Zellaufschlusses entwickelt. Mit Hilfe einer Software für experimentelles Design wurden Versuchspläne erstellt, die in einem Datenbanksystem für den Pipettierroboter abrufbar gespeichert wurden. In drei Experimenten wurde die optimale Mischung von EDTA, Lysozym, Triton X-100 und Polymyxin B bestimmt. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Produkten wies der Puffer eine vergleichbare Performance auf. Im Rahmen der dritten Publikation wurde das Produktbildungsprofil von Hefekulturen in parallelen miniaturisierten Fed-Batch Kulturen untersucht und eine Abhängigkeit der spezifischen Produktbildungsrate von der spezifischen Wachstumsrate festgestellt. Das Produktbildungsprofil wurde mit einer kontinuierlichen Kultivierung verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die aus den miniaturisierten Kulturen gewonnenen Daten mit dem 1,5 L Bioreaktor vergleichbar sind. Eine Charakterisierung von Hefestämmen in Mikrowellplatten bietet sich demnach an, um zeit- und kostenintensive Experimente in Bioreaktoren zu minimieren. Die entwickelten Plattformtechnologien bieten eine Grundstruktur zur schnelleren Versuchsplanung, -durchführung und -auswertung. Durch die Beibehaltung der Rahmenbedingungen des Produktionsmaßstabes während der Produkt- und Prozessentwicklung können Entwicklungszeit und -kosten von biotechnologischen Produktionsprozessen verringert werden, was schlussendlich zu einer weiteren Verbreitung von nachhaltigen Produktionsmethoden führen wird.BMBF, 02PJ1150, Autobi