Fortgeschrittene Raman-Spektroskopie zur Überwachung von Bioprozessen

The Raman -effect was discovered almost 90 years ago. It took a long time until the importance of Raman spectroscopy was fully understood and accepted for process industrial applications. Still today the usage is limited to a small application area. During the last decades advances in the production of spectroscopic components have reduced the complexity of the instrumentation and further mediated a persistent decline in costs, thus making this technology available for a broader audience. The basic components of a Raman spectrometer are a monochromatic light source, typically laser, a Raman probe with optical fibres, a spectrograph and a detector which is connected to a measurement- and control PC. Raman spectroscopy is increasingly becoming a choice as analytical tool in bioanalytics. Most of biological samples are handled in aqueous form which challenges many other analytical techniques (e.g., infrared spectroscopy). Raman and its enhancement techniques are able to measure quality and quantity of compounds in liquid phase with no or very little interference of water. The quantity of a compound can be determined by the peak-intensity and the quality by the position in the measured spectrum. Another advantage is that Raman spectroscopy does not rely on extensive sample preparation and measurements can be carried out non-invasively by placing an immersion probe with fibre optics directly in the liquid media. A Raman measurement is conducted fast, within milliseconds, and multiple relevant process parameters from the same sample can be measured at the same time. The measurements can be performed in continuous mode, i.e. one after the other or with a delay in-between. The operator can determine the measurement interval and in this way the development of a process can be observed online and in real-time. Further important advantages of spectroscopic methods over many other biochemical and physical measurement tools are the robustness as they do not require assays and they are rather unsusceptible against variations of pH, temperature changes, vibrations and other process parameters. If there is no coating, colour or special treatment of the glass, some Raman set-ups allow measurements directly through the glass into the liquid phase. This option enables real process measurements without the need to disturb or contaminate the analytes. These experimental set-ups are in the focus of this thesis. Despite great advantages of spectroscopic methods, the utilization is often complicated since the threshold values are often above what is required for screening. Besides the lack of sensitivity of conventional Raman in bioprocess applications, the major drawback of this technique so far has been the disturbance of the broad fluorescence background especially in biological samples. The main objective of this thesis was to find solutions for increasing the limit of detection (LOD) for biomolecules, being capable to detect them during the course of the process reliably and being able to diminishing background signals induced by sample- and matrix-related auto-fluorescence. The proposed solutions are mainly surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), time-gated (TG) Raman spectroscopy and the combination of both. This thesis had a rather broad scope ranging from biofilm detection on water membrane filtration processes, over low-concentration bacteria detection with various enhancement options to finally follow the course of cell culture media development during cultivations. The aim of the thesis is to show that in challenging bioprocess-environments, Raman spectroscopy can detect weak signals over the background-noise from fluorescence in combination with SERS-enhancement-sensor techniques and with the time-gated Raman technology in particular.Der Raman-Effekt wurde schon vor fast 90 Jahren entdeckt. Anerkennung und Akzeptanz dieser Technologie für den Einsatz in der Verfahrenstechnik brauchten eine lange Zeit, wobei derzeit die Anwendungsbereiche noch sehr beschränkt sind. In den letzten Jahrzehnten haben technologische Fortschritte in der Produktion von optischen Komponenten, insbesondere von Lasern und Detektoren, die Komplexität von Raman-Spektrometern erheblich reduziert. Kostenreduzierung von Komponenten und Vereinfachung der Instrumente ermöglicht jedoch ein breiteres Anwenderfeld. Die Hauptkomponenten eines Raman-Spektrometers sind eine monochromatische Lichtquelle, typischerweise Laser, eine Raman-Sonde mit Lichtleitern, ein Spektrograph und ein Detektor, der mit einem Mess- und Steuer-PC verbunden ist. Die Raman-Spektroskopie wird zunehmend als analytisches Instrument in der Bioanalytik eingesetzt. Die meisten biologischen Proben werden in wässriger Form behandelt, was viele andere analytische Techniken (z.B. Nahinfrarotspektroskopie) herausfordert. Raman und insbesondere die oberflächen-verstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) sind in der Lage, organische und anorganische Verbindungen in flüssigen Proben ohne großen Einfluss der Wasserbanden zu charakterisieren. Unter konstanten Messbedingungen ermöglichen Raman und SERS auch die Quantifizierung von Komponenten in der Probe. Hauptsächlich ermöglicht SERS aber die Bestimmung von Komponenten in sehr geringen Stoffkonzentrationen. Die Quantität eines Stoffes kann durch die Peak-Intensität und die Qualität durch die Position der Peaks im gemessenen Spektrum ermittelt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Raman-Spektroskopie nicht eine umfangreiche Probenvorbereitung benötigt und Messungen nicht-invasiv durchgeführt werden können. Eine faseroptische Raman-Sonde (spezielle Tauchsonde) kann auch für den Einsatz direkt in flüssigen Medien benutzt werden. Eine Raman-Messung kann sehr schnell (innerhalb von wenigen Millisekunden) durchgeführt und es können mehrere relevante Prozessparameter gleichzeitig bestimmt werden. Die Messungen können kontinuierlich, nacheinander oder in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden. Auf diese Weise kann die Entwicklung eines Prozesses online und in Echtzeit beobachtet werden. Weitere wichtige Vorteile spektroskopischer Methoden gegenüber vielen anderen biochemischen und physikalischen Messwerkzeugen sind die Robustheit, da sie keine speziellen Assays erfordern, und sie sind eher unempfindlich gegenüber Variationen von Prozessparametern wie z.B. pH, Temperaturänderungen, Druck und Vibrationen. Falls es keine Beschichtungen, Einfärbungen oder spezielle Behandlungen des Glases gibt, erlauben einige Raman-Aufbauten Messungen direkt durch Glas in das flüssige Medium, z.B. durch Glasbehälter oder Küvetten. Diese Optionen ermöglichen reale Prozessmessungen von Proben ohne die Notwendigkeit die Analyten zu stören oder zu kontaminieren. Neben Durchflusszellen stehen diese experimentellen Aufbauten im Fokus dieser Arbeit. Trotz großer Vorteile der Raman-Spektroskopie, ist die Realisierung robuster Messergebnisse oftmals kompliziert, da die Schwellenwerte der Stoffkonzentrationen von den meisten Analyten in Bioprozessen oft unterhalb der Nachweisgrenze liegen. Neben dem Mangel an hoher Empfindlichkeit von konventionellem Raman bei Bioprozessanwendungen war der größte Nachteil dieser Technik bisher die Störung des breiten Fluoreszenzhintergrundsignals, welches das eigentliche Raman-Signal zum Teil stark überlagert. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, Lösungen für die Verbesserung der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) für Biomoleküle zu finden, um in der Lage zu sein, den Prozessverlauf und einzelne Organismen zuverlässig charakterisieren zu können. Die vorgeschlagenen Lösungen sind vor allem die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS), die zeitaufgelöste (time-gate, TG) Raman-Spektroskopie und die Kombination beider. Diese Doktorarbeit bearbeitet ein recht breites Feld von Anwendungen, angefangen von Biofilm-Erkennung auf Filtermembranen bei der Trinkwasseraufbereitung, über die Erkennung von Bakterien in sehr geringen Konzentrationen mit verschiedenen SERS Nanopartikeln und Oberflächensubstraten bis zur Messungen der Zusammensetzung von Zellüberstandproben während einer kompletten Kultivierung. Das Ziel dieser Arbeit ist es, in unterschiedlichen Einsatzfeldern von Bioprozessen zu zeigen, wie weiterentwickelte Raman-Spektroskopische Methoden eingesetzt werden können, um die sehr geringen biochemischen Signale vom störenden Einfluss der Hintergrundsignale, insbesondere der Fluoreszenz, unterscheiden und charakterisieren zu können