The Effect of Bone Marrow-Derived Mesencyhmal Stem Cell to Cause of Central Nerve System Damage Use of Valproic Acid in Pregnant Rats

Epilepsi; kortikal nöronlardaki anormal ve aşırı elektriksel deşarj sonucu ortaya çıkan, ani ve tekrarlayıcı tanımlanabilen bir olayla tetiklenmemiş nöbetlerle karakterize bir hastalıktır. Epilepsi hastalığı tüm dünyada yaygın bir şekilde görülür. Hiçbir etnik fark, cinsiyet ayrımı, yaş sınırı ve sosyal sınıf tanımayıp, dünyada 50 milyon insanı etkilediği tahmin edilmektedir. Epilepsi tedavisinde çeşitli antiepileptik ilaçlar kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları benzodiazepin, GABA (Gama aminobütirik asit) analogları ve hormonlardır. Epilepsi tedavisinde kullanılan diğer bir antiepileptik ilaç valproik asittir. Ancak valproik asitin gebelikte kullanılımı çok önemli yan etkilere neden olmaktadır. En önemli yan etkileri; spina bifida, myelomeningosel gibi nöral tüp defektleri, kol ve bacak malformasyonları, dudak yarığı, kardiyovasküler malformasyonlar ve fasiyel dismorfizimdir. Bu verilerden yola çıkarak bu çalışmada gebe sıçanlarda valproik asitin kullanımına bağlı olarak fetüste oluşabilecek nöral tüp defektlerine ve/veya diğer konjenital malformasyonlara, merkezi sinir sistemi hasarına kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin etkinliğini araştırmayı hedefledik. Çalışmamızda 24 erişkin “Wistar Albino” dişi sıçan gebeliklerinin 9. günlerinde deney ve kontrol olmak üzere 2 farklı gruba ayrıldı. Deney grubundaki gebeliklerinin 9. gününde olan 16 sıçanın 8’ine subkutan yolla valproik asit (VPA) enjekte edilirken diğer 8’ine ise hem VPA (subkutanöz) hem de sıçan kemik iliğinden elde ettiğimiz mezenkimal kök hücreler aynı gün kuyruk veninden enjekte edildi. Kontrol grubunda olan 8 sıçana ise gebeliklerinin 9. gününde kuyruk veninden Phosphate Buffered Saline (PBS) verildi. Çalışmaya dahil edilen 24 adet “Wistar Albino” cinsi gebe sıçandan gebeliklerinin 21. gününde alınan fetüslerin beyin ve omurilikleri çıkarıldı. Tespit edildikten sonra bu dokular Hematoksilen&Eozin ve Toluidin Blue O boyaları ile histokimyasal; S100b ile immunohistokimyasal olarak incelendi.KABUL VE ONAY SAYFASI i TEŞEKKÜR ii İÇİNDEKİLER iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ix ŞEKİLLER DİZİNİ x RESİMLER DİZİNİ xii TABLOLAR DİZİNİ xv EKLER DİZİNİ xvi ÖZET xvii ABSTRACT xviii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Epilepsi 3 2.1.1. Epilepsi Sendromları Uluslararası Sınıflandırılması 4 2.1.2. Epilepsi Tedavisinde Kullanılan İlaçlar ve Etki Mekanizmaları 4 2.2. Valproik Asit 5 2.2.1. Valproik Asitin Etki Mekanizması 5 2.3. Sinir Sistemi Embriyolojisi 6 2.3.1. Embriyonik Germ Tabakalarının Oluşumu 6 2.3.2. Notokord Oluşumu 9 2.3.3. Nörulasyon ve Nöral Tüp Oluşumu 11 2.3.4. Nöral Krest Oluşumu 12 2.3.5. Somitlerin Gelişimi 13 2.3.6. Somitlerin Farklanması 14 2.4. Anormal Nörulasyon Sonucu Embriyoda Meydana Gelen Defektler 15 2.4.1. Nöral Tüp Defektleri 15 2.5. Merkezi Sinir Sistemi 16 2.5.1. Merkezi Sinir Sisteminin Organizasyonu 16 2.5.2. Beynin Yapısı 17 2.5.2.1. Glia Hücreleri 18 2.5.2.1.1. Astrositler 18 2.5.2.1.1.1. Fibröz astrositler 18 2.5.2.1.1.2. Protoplazmik astrositler 19 2.5.2.1.2. Oligodendrositler 19 2.5.2.1.3. Ependim hücreleri 19 2.5.2.1.4. Mikroglialar 19 2.5.3. Omuriliğin Yapısı 20 2.5.4. Merkezi Sinir Sistemi Histolojisi 21 2.5.4.1. Meninksler 21 2.5.4.1.1. Dura mater 21 2.5.4.1.2. Araknoid 21 2.5.4.1.3. Pia Mater 22 2.5.4.2. Koroid pleksus ve beyin-omurilik sıvısı/serebrospinal sıvı 22 2.6. Merkezi Sinir Sistemi Embriyolojisi 23 2.6.1. Omuriliğin Gelişimi 23 2.6.2. Meninkslerin Gelişimi 24 2.6.3. Beynin Gelişimi 24 2.6.3.1. Rombensefalon: Arka beyin 24 2.6.3.2. Myelensefalon 25 2.6.3.3. Metensefalon 25 2.6.3.4. Mezensefalon (Orta beyin) 26 2.6.3.5. Prosensefalon (Ön beyin) 26 2.6.3.6. Diensefalon 26 2.6.3.7. Telensefalon 27 2.7. Sıçanda Sinir Sisteminin Kökeni ve Anatomisi 27 2.8. Beyine Özgü Bazı Belirteçler ve Biyokimyasal Özellikleri 28 2.8.1. 14-3-3 Protein Ailesi 28 2.8.2. 14-3-2 Protein Ailesi (NSE) Nöron Spesifik Enolaz 28 2.8.3. S100 28 2.8.3.1. S100b 29 2.8.4. Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP) 29 2.8.5. Miyelin bazik proteini (MBP) 30 2.8.6. N-asetil-L-aspartat (NAA) 30 2.9. Kök Hücre 30 2.9.1. Farklılaşma Kapasitelerine Göre Kök Hücreler 31 2.9.2. Elde Edildikleri Kaynaklarına Göre Kök Hücreler 32 2.9.2.1. Embriyonik olmayan kök hücreler 33 2.9.2.1.1. Mezenkimal kök hücreler (MKH) 33 2.9.3. Mezenkimal Kök Hücrelerin Karakterizasyonu 35 2.9.4. Mezenkimal Kök Hücrelerin İmmünolojik Özellikleri 35 2.9.5. Kemik İliği Kökenli Kök Hücreler (BM_MSCs) 35 2.9.6. Mezenkimal Kök Hücrelerin Klinikte Tercih edilme Nedenleri 36 2.9.7. Mezenkimal Kök Hücre Belirteçleri 36 3. GEREÇ VE YÖNTEM 38 3.1. Kullanılan Deney Hayvanları ve Deney Grupları 38 3.1.1. Deney Grupları 38 3.2. Sıçan Kemik İliği Kökenli Mezenkimal Kök Hücre Elde Edilmesi 39 3.2.1. Hücre Kültür İşlemleri 39 3.2.1.1. RFP (Red Fluorescent Protein) ile mezenkimal kök hücrelerin işaretlenmesi 40 3.2.1.2. Hücre canlılık testi 40 3.2.1.3. Mezenkimal kök hücrelerin akım sitometrik analizi 40 3.3. İmmünofloresan İnceleme 41 3.4. Dokuların Elde Edilmesi 41 3.5. Işık Mikroskobik İnceleme için Dokuların Takibi 42 3.5.1. Hematoksilen & Eozin Boyama Protokolü 42 3.5.2. Toluidine Blue O Boyama Protokolü 43 3.6. İmmünohistokimyasal Boyama 43 4. BULGULAR 46 4.1. Hücre Kültürü ve İmmünofenotiplendirilmesi 46 4.1.1. Sıçan Kemikiliğinden İzole Edilmiş Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü ve İmmünofenotiplendirilmesi 46 4.1.2. Kök Hücre Belirteçleri Kullanılarak Akım Sitometri İle Hücrelerin Mezenkimal Kök Hücre Olduğunun Gösterilmesi 47 4.1.3. Kemikiliği Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücre Varlığının RFP ile ölçülmesi 49 4.2. Kontrol Grubu Beyin Dokusu Hematoksilen Eozin Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 51 4.3. VPA Grubu Beyin Dokusu Hematoksilen Eozin Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 52 4.4. VPA Grubu Beyin Dokusu Hemotoksilen Eozin Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 54 4.5. Kontrol Grubu Omurilik Dokusu Servikal Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 55 4.6. Kontrol Grubu Omurilik Dokusu Torakal bölge Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 58 4.7. Kontrol Grubu Omurilik Dokusu Lumbar bölge Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 60 4.8. Kontrol Grubu Omurilik Dokusu Sakral bölge Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 63 4.9. VPA Grubu Omurilik Dokusu Servikal bölge Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 65 4.10. VPA Grubu Omurilik Dokusu Torakal bölge Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmünohistokimyasal Bulguları 68 4.11. VPA Grubu Omurilik Dokusu Lumbar Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 70 4.12. VPA Grubu Omurilik Dokusu Sakral Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 73 4.13. VPA+Kök Grubu Omurilik Dokusu Servikal Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 75 4.14. VPA+Kök Grubu Omurilik Dokusu Torakal Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 78 4.15. VPA+Kök Grubu Omurilik Dokusu Lumbar Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 80 4.16. VPA+Kök Grubu Omurilik Dokusu Sakral Bölge Hematoksilen Eozin ve Toluidin Blue O Histokimyasal ve S100b İmmunohistokimyasal Bulguları 83 4.17. Histolojik Bulgular 85 4.17.1. Beyin Dokusu Hemotoksilen Eozin Histokimyasal, İmmünohistokimyal Bulguları 85 4.17.2. Omurilik Dokusu Hemotoksilen Eozin ve Toluidin Blue Histokimyasal Bulguları 86 4.17.2.1. S100-Beta İmmünohistokimya boyama bulguları 87 4.18. Makroskobik Bulgular 88 4.19. İstatistiksel Analiz 89 5. TARTIŞMA 93 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 95 KAYNAKLAR 96 EKLER 100 ÖZGEÇMİŞ 10