Genomweite Identifizierung Virulenz-assoziierter Gene in Staphylococcus aureus mittels Transposon-Sequenzierung

Staphylococcus aureus asymptomatically colonises one third of the healthy human population, finding its niche in the nose and on skin. Apart from being a commensal, it is also an important opportunistic human pathogen capable of destructing tissue, invading host cells and killing them from within. This eventually contributes to severe hospital- and community-acquired infections. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), resistant to commonly used antibiotics are protected when residing within the host cell. This doctoral thesis is focused on the investigation of staphylococcal factors governing intracellular virulence and subsequent host cell death. To initiate an unbiased approach to conduct this study, complex S. aureus mutant pools were generated using transposon insertional mutagenesis. Genome-wide infection screens were performed using these S. aureus transposon mutant pools in vitro and in vivo, followed by analysis using Transposon insertion site deep sequencing (Tn-seq) technology. Amongst several other factors, this study identified a novel regulatory system in S. aureus that controls pathogen-induced host cytotoxicity and intra-host survival. The primary components of this system are an AraC-family transcription regulator called Repressor of surface proteins (Rsp) and a virulence associated non-coding RNA, SSR42. Mutants within rsp exhibit enhanced intra-host survival in human epithelial cells and delayed host cytotoxicity. Global gene-expression profiling by RNA-seq demonstrated that Rsp controls the expression of SSR42, several cytotoxins and other bacterial factors directed against the host immune system. Rsp enhances S. aureus toxin response when triggered by hydrogen peroxide, an antimicrobial substance employed by neutrophils to destroy pathogens. Absence of rsp reduces S. aureus-induced neutrophil damage and early lethality during mouse pneumonia, but still permits blood stream infection. Intriguingly, S. aureus lacking rsp exhibited enhanced survival in human macrophages, which hints towards a Trojan horse-like phenomenon and could facilitate dissemination within the host. Hence, Rsp emerged as a global regulator of bacterial virulence, which has an impact on disease progression with prolonged intra-cellular survival, delayed-lethality but allows disseminated manifestation of disease. Moreover, this study exemplifies the use of genome-wide approaches as useful resources for identifying bacterial factors and deduction of its pathogenesis.Staphylococcus aureus ist ein fakultativ pathogener Kommensale des Menschen und besiedelt bei etwa einem Drittel der Bevölkerung überwiegend den Nasen-Rachenraum sowie die Haut ohne klinische Symptome auszulösen. Darüber hinaus zählen diese Bakterien zu den wichtigsten Vertretern der Kranken- hauskeime, die schwerwiegende Infektionen besonders im Bereich der Intensivstationen in Kranken- häusern hervorrufen können. Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) sind dabei resistent gegen übliche Antibiotika und daher schlecht therapierbar. Neuere Forschungsarbeiten zeigten, dass S. aureus von Zellen des Wirts aufgenommen wird und diese von innen heraus abzutöten vermag. Über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Zelltoxizität ist jedoch nicht viel bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollten daher Faktoren von S. aureus identifiziert und charakterisiert wer- den, die die intrazelluläre Virulenz des Bakteriums und das darauf folgende Absterben der Wirtszelle beeinflussen. Dafür wurden mittels Transposon-Insertionsmutagenese S. aureus Mutanten-Bibliotheken erstellt, welche für genomweite Infektionsscreens in vitro und in vivo genutzt wurden. Die Auswertung dieser Analysen erfolgte dabei durch Hochdurchsatz-Sequenzierung der Transposon-Insertionsstellen (Tn-seq). In diesen Studien wurde neben zahlreichen bakteriellen Faktoren ein neuartiges Virulenzreg- ulator - System identifiziert. Dieses System besteht aus dem Transkriptionsregulator der AraC-Familie Repressor of surface proteins (Rsp) und einer nicht-kodierenden RNA, SSR42. rsp-Mutanten zeigten eine erhöhte intrazelluläre Überlebensrate in menschlichen Epithelzellen sowie eine verzögerte Cytotoxizität im Wirt. Durch RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wurde der Einfluss von Rsp auf die globale Genexpres- sion ermittelt. Dabei zeigte sich, dass Rsp die Expression von SSR42, sowie Cytotoxinen und anderen immunmodulatorischen Faktoren von S. aureus kontrolliert. Wasserstoffperoxid, ein Molekül, welches durch Neutrophile zur Bekämpfung von Pathogenen gebildet wird, führt dabei Rsp-abhängig zu einer Erhöhung der bakteriellen Toxinproduktion. Die Abwesenheit von Rsp in bakteriellen Mutanten res- ultiert in einer Reduktion S. aureus-induzierter Zerstörung von Neutrophilen sowie zum Überleben von Versuchstieren im Lungeninfektionsmodell. Eine systemische Infektion ist dabei jedoch weiterhin mög- lich. Interessanterweise führt ein Fehlen des rsp zu einer erhöhten Überlebensrate von Makrophagen, welches auf eine Verbreitung der Bakterien im Organismus in diesem Zelltyp hindeuten könnte. Rsp ist demnach ein neuartiger globaler Regulator bakterieller Virulenz, der zwar die infektions- bedingte Letalität verzögert, jedoch damit eine Disseminierung der Infektion mit S. aureus begünstigt