Informe científico de Beca de Perfeccionamiento: Castaingts, Mélisse (2015)

Durante el primer año de beca, me dediqué a generar el material biológica y llevar adelante la construcción de bibliotecas de pequeños RNAs (sRNAs) de raíces de Phaseolus vulgaris inoculadas con cepas de Rhizobium etli de alta y baja eficiencia en la nodulación. Para ello, se generaron tres réplicas biológicas de tejido de raíces de P. vulgaris de la variedad mesoamericana NAG12, que fue colectado 24 horas después de la inoculación con los rizobios. A partir de dicho tejido se aisló el RNA total, se purificó el RNA de bajo peso molecular y se generaron bibliotecas de small RNAs, las cuales se secuenciaron utilizando la tecnología Illumina. Se utilizaron dos réplicas biológicas de las tres condiciones ensayadas: raíces inoculadas con el medio de cultivo sin bacteria (condición control), inoculadas con SC15 (bacteria la más eficiente) y 55N1 (menos eficiente) obteniéndose un total de seis bibliotecas. En el segundo año de beca, iniciamos el análisis bioinformático de las lecturas obtenidas por secuenciacion masiva. Usando el programa de herramientas para análisis de sRNAs (UEA Workbench toolkit, Stocks et al., 2012), se descartaron las secuencias correspondientes a los adaptadores libres y se aplicaron filtros por tamaño y calidad. Luego, se descartaron las secuencias que corresponden a RNA de transferencia (RNAt) y RNA ribosomales (RNAr), y las secuencias que no mapearon contra el genoma de referencia de P. vulgaris (Schmutz et al., 2014). El análisis continuó con la categorización de estos sRNAs usando herramientas del UEA Workbench toolkit que permiten identificar microRNAs (miRNAs), nuevos o conocidos (comparando con la base de datos de miRBase) o tasiRNAs (trans-acting small interference RNAs). Finalmente, la herramienta SiLoCo permitió comparar los perfiles de expresión de los loci de sRNAs entre dos muestras. Este análisis se aplicó para cada replica biológica comparando la cepa más eficiente contra la menos eficiente, y, contra la condición control. Este año hemos continuado el analisis funcional de varios miRNAs en la interacción P. vulgaris x R. etli, para los cuales estudios de expresión previos indican que podrían cumplir algún rol importante durante la asociación simbiótica. Entre ellos se encuentran varias isoformas del miR169 y el miR390. Ensayos de RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) nos permitieron analizar la expresión de dicho precursores en distintos órganos y tejidos de P. vulgaris, revelando que algunas de las isoformas del miR169 se expresan específicamente en nódulos formados por la cepa más eficiente. Para analizar la función de estos miRNAs utilizamos una estrategia que involucra la obtención de plantas que acumulan altos niveles (sobreexpresión) de dichos miRNAs y el análisis fenotípico asociado a la nodulación (cinéticas de nodulación). Utilizando cDNAs como molde, se amplificaron los precursores de miR169 y miR390, los cuales fueron clonados en el vector pENTRY/D/TOPO. Dichos clones fueron enviados a secuenciación y luego de confirmar su identidad, los mismos fueron recombinados en el vector pK7WGD2,1 y utilizados para la transformación de raíces de poroto mediada por Agrobacterium rhizogenes. Ademas hemos realizado estudios del fenotipo de raíz de estas plantas (medición del largo de raíces principales y secundarias), las cuales sobreexpresan los precursores de dichos miRNAs para determinar el rol eventual de los mismos. Para los experimentos de análisis funcional, los niveles de expresión de los precursores de miRNAs fueron validados por RT-qPCR. Por otra parte, hemos avanzado el análisis de las bibliotecas de sRNAs determinando miRNAs con expresión diferencial en cada condición y nuevos tasiRNAs específicos que surjan de la interacción con rizobios. Además hemos realizado dos replicas biológicas adicionales de plantas cuyo raíces fueron colectadas a 24h después de la inoculación. Con estas muestras hemos generado dos bibliotecas de sRNAs suplementarias para incrementar la validez estadística del análisis de los datos