Développement de stratégies analytiques basées sur la LC-MS/MS pour la recherche de traces de pesticides et métabolites dans des matrices apicoles

For several years, abnormally high mortalities have been observed in bees worldwide. Several factors may be responsible for these phenomena, including the use of pesti-cides. Among these, insecticides of the family of neonicotinoids and pyrethroids as well as some fungicides of the carboxamide family are implicated. The work presented is devoted to the development of analytical methods for the identification, detection and quantification of 13 pesticides and their metabolites in bees and hive products such as beebread and beeswax.Initially, an original dSPE method was developed for the extraction of targeted pesti-cides in beeswax. Combined with a liquid chromatographic analysis method coupled to triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS), it allows to reach limits of quantification never reached before in multi-families analysis on this complex matrix, between 1 and 40 ng.g-1.The application of this method to beeswaxes and the analysis of other beekeeping matrices provided by beekeepers (a total of 488 samples including 125 bees, 87 bees-waxes and 276 honeybees) showed a wide presence of these pesticides in french apiar-ies. Overall, beeswax is the matrix with the highest concentrations and beebread is the most contaminated matrix in terms of number of pesticides present.A second part of the work is devoted to the detection and identification of pesticide metabolites generated by in vitro and in vivo experiments. For this, an analytical strategy, based on the complementarity between time-of-flight and triple-quadrupole mass spectrometry, has been put in place. The first allows the identification of me-tabolites by combining the search for known metabolites and specific isotopic profiles (Cl, Br, S). The second allows their detection and quantification in bee samples.This dual approach has identified 9 pesticide metabolites and 5 markers of exposure. Metabolites and markers of exposure to boscalid (carboxamide), mainly derived from hydroxylation, dehalogenation and substitution reactions, have been synthesized. These were then detected and quantified in bee samples from symptomatic apiaries.These analytical developments and results make it possible, on the one hand, to make an inventory of the presence of pesticides of concern in french apiaries. On the other hand, they provide ecotoxicologists with data to better understand the behavior of pesticides in beesDepuis plusieurs années, des mortalités anormalement élevées sont observées chez les abeilles, au niveau mondial. Plusieurs facteurs peuvent être à l’origine de ces phénomènes, dont l’utilisation de pesticides. Parmi ceux-ci, les insecticides de la famille des neonicotinoides et des pyrethrinoides ainsi que certains fongicides de la famille des carboxamides sont mis en cause. Les travaux présentés dans ce manuscrit sont consacrés au développement de méthodes analytiques pour l’identification, la détection et la quantification de 13 pesticides et leurs métabolites dans les abeilles et les produits de la ruche tels que le pain d’abeille et la cire d’abeille. Dans un premier temps, une méthode originale par dSPE a été développée pour l’extraction des pesticides cibles dans la cire d’abeille. Combinée à une méthode d’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse triple quadripole (UPLC-MS/MS), elle permet d’atteindre des limites de quantification jamais atteintes auparavant en multi-familles sur cette matrice complexe, comprises entre 1 et 40 ng.g-1. L’application de cette méthode sur des cires ainsi que l’analyse d’autres matrices apicoles fournis par des apiculteurs (au total 488 échantillons dont 125 abeilles, 87 cires et 276 pains d’abeille) ont montré une large présence de ces pesticides dans les ruchers français. Globalement, la cire d’abeille est la matrice présentant les plus fortes concentrations et le pain d’abeille est la matrice la plus contaminée en termes de nombre de pesticides présents. Une seconde partie des travaux est dédiée à la détection et à l’identification des métabolites de pesticides générés par des expérimentations in vitro et in vivo. Pour cela, une stratégie analytique, basée sur la complémentarité entre la spectrométrie de masse à temps de vol et triple quadripole, a été mise en place. La première permet l’identification des métabolites par la combinaison de la recherche de métabolites connus et de profils isotopiques spécifiques (Cl, Br, S). La seconde permet leur détection et leur quantification dans des échantillons d’abeille. Cette double approche a notamment permis d’identifier 9 métabolites de pesticides et 5 marqueurs d’exposition. Des métabolites et marqueurs d’exposition au boscalide (carboxamide), principalement issus de réactions d’hydroxylation, deshalogenation et substitution, ont été synthétisés. Ces derniers ont ensuite été détectés et quantifiés dans des échantillons d’abeilles issus de ruchers symptomatiques. Les développements analytiques et résultats permettent, d’une part, de faire un état des lieux de la présence de pesticides jugés préoccupants dans les ruchers français. D’autre part, ils fournissent aux écotoxicologues des données permettant de mieux comprendre les modes d’action des pesticides chez les abeille