Caractérisation génomique des mutations du gène CXCR4 dans la maladie de Waldenstrom

Purpose. Waldenstrom macroglobulinemia (WM) is a B-cell malignancy characterized by bone marrow infiltration of clonal lymphoplasmacytic cells, which produce a monoclonal immunoglobulin M (IgM). MYD88L265P mutation may be considered as a founder event because of it high frequency in WM. Whole-genome sequencing has revealed CXCR4 mutations (CXCR4Mut) in WM. CXCR4 is a G-protein-coupled receptor that promotes migration and activation of several pathways including RAS, Akt and NFKB. CXCR4 mutation has proved to be of critical importance in WM, in part due to its role as a mechanism of resistance to several agents of targeted therapy. We have therefore sought to unravel the different aspects of CXCR4 mutations in WM using next generation sequencing, and SNP (single nucleotide polymorphism) arrays and to study the clinical impact.Experimental Design. Bone marrow samples of 98 patients with WM (mean age: 67 years) were analyzed. Tumoral DNA was extracted following CD19 B cell selection. Paired samples (tumor/T lymphocytes) were used as an intra-individual reference. CXCR4 mutation was analyzed by ultra deep targeted NGS (next generation sequencing) (all exons) allowing study of the clonal architecture in WM cells and/or sanger sequencing (SaS) (exon 2). Mutational spectrum of 8 candidate genes involved in Toll Like Receptor, RAS and B Cell Receptor (BCR) pathway along with MYD88L265P, CD79A (ITAM domain), CD79B( ITAM domain), CARD11 (exon 5-9), N RAS (exon 2-3), K RAS (exons 2-3), BRAF6 (exon 15), PTEN( exon 5-7), was also analysed in an integrative study. Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix chips) was performed in 53 patients to decipher genomic signature of CXCR4Mut. Flow cytometry was performed to assess CXCR4 and CD49d (VLA4) expression (n=53).Results. We found all mutations to be heterozygous, somatic and located in the C-terminal domain of CXCR4 in 24.5% of the WM. CXCR4 mutations led to a truncated receptor protein. Among the 17 variants, 12 new variants were identified in WM. The most frequent mutation was the CXCR4 C1013G (S338X) mutation (5/98) followed by CXCR4C1013A (S338X) (3/98). Interestingly, CXCR4Mut was associated to higher expression of CXCR4 protein by flow cytometry, independently of the type of CXCR4 mutation (n=53) (p=0.003). No impact on the expression profile of the integrin VLA4 (CD49d) which directly interacts with CXCR4 was observed. Sub clonal CXCR4 mutations identified using NGS were identified in 4/14 cases. CXCR4 mutations pertain to the same clone as to MYD88 L265P mutations, but were mutually exclusive to CD79A/ CD79B mutations (BCR pathway). We identified a genomic signature in CXCR4Mut WM traducing a more complex genome. CXCR4 mutations were also associated with gain of chromosome 4 (p=0.002), gain of Xq (p=0.002) and deletion 6q (p=0.038) and a higher number of genomic abnormalities (5.8 versus 2.8 per patient, p=0.046). We thought to identify clinical-biologic characteristics of WM with CXCR4Mut features. CXCR4 mutations were associated with higher IgM monoclonal component (p=0.006) and thrombocytopenia (p=0.018). However, no impact in overall survival was observed according to CXCR4 mutational status. Conclusions. Our study panned out new CXCR4 mutations in WM, and identified a specific signature associated to CXCR4Mut, characterized with complex genomic aberrations among MYD88L265P WM. The study of CXCR4 mutations showed existence of intraclonal (variation in co-expression of MYD88 and CXCR4 mutations) and interclonal (BCR and CXCR4 mutations in MYD88L265P WM) heterogeneity. Our results suggest the existence of various genomic subgroups in WM.Contexte: La maladie de Waldenstrom (MW) est un syndrome lymphoprolifératif B caractérisé par une infiltration de la moelle osseuse par des lymphoplasmocytes et un pic monoclonal de type IgM. La mutation MYD88L265P est considérée comme un événement fondateur dans cette hémopathie. Les études par séquençage complet du génome ont identifié des mutations du gène CXCR4 (CXCR4 Muté) dans la MW. CXCR4 est un récepteur couplé aux protéines G qui participe aux processus de migration cellulaire et d’activation de différentes cascades de signalisation parmi lesquelles figurent RAS, Akt et NFKB. Les mutations de CXCR4 joueraient un rôle important dans la physiopathologie de la MW et dans les mécanismes de chimiorésistance de certaines thérapeutiques ciblées. Notre objectif a été d’étudier le profil génomique des MW avec mutations CXCR4 par séquençage à haut débit ciblé et par puces à SNP (single nucleotide polymorphism) et d’évaluer leur impact clinique. Matériel et Méthodes. Les échantillons de moelle osseuse de 98 MW ont été analysés. L’ADN tumoral a été extrait après sélection des cellules B. Des échantillons appariés (tumeur/ lymphocytes T) ont été utilisés comme référence intra-individuelle. Les mutations de CXCR4 ont été étudiées en séquençage ciblé à haut débit (NGS) ce qui a permis d’évaluer l’architecture clonale dans les cellules tumorales de MW et /ou par séquençage Sanger (exon 2). Le spectre mutationnel de 8 gènes candidats impliqués dans les voies des Toll Like Receptor, RAS et du BCR a été étudié : MYD88L265P, CD79A (domaine ITAM), CD79B (domaine ITAM), CARD11 (exon 5-9), N RAS (exon 2-3), K RAS (exons 2-3), BRAF6 (exon 15), PTEN (exon 5-7). L’analyse des profils génomiques a été réalisée en puces à SNP (Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix chips) dans une cohorte de 53 patients. L’expression de CXCR4 et du CD49d (VLA4) ont été étudiées en cytométrie de flux (n=53). Résultats. Nous avons identifié une mutation de CXCR4 dans 24.5% des MW. Toutes mutations sont hétérozygotes, acquises et localisées dans le domaine C terminal de la protéine. Parmi les 17 variants observés, nous identifions 12 nouvelles mutations dans la MW. Les mutations les plus fréquentes sont le variant C1013G (S338X) (5/98) et la mutation C1013A (S338X) (3/98). Les mutations de CXCR4 muté sont associées à une plus forte expression de la protéine CXCR4 en cytométrie de flux, indépendamment du type de mutations de CXCR4 (n=53) (p=0.003). Aucun impact en terme de niveau d’expression de l’intégrine VLA4 (CD49d), qui interagit directement avec CXCR4, n’est observé. Des mutations sous clonales de CXCR4 sont identifiées en NGS dans 4/14 cas. Les mutations de CXCR4 sont présentes dans le même clone que MYD88 L265P, mais sont mutuellement exclusives des mutations de la voie du BCR (CD79A / CD79B). Nous avons ensuite identifié une signature génomique plus complexe dans le groupe des MW CXCR4 muté. Les mutations de CXCR4 sont associées aux gains du chromosome 4 (p=0.002), aux gains en Xq (p=0.002), aux délétions 6q (p=0.038) et présentent un nombre d’anomalies plus élevées (5.8 versus 2.8 per patient, p=0.046). Nous avons ensuite cherché à caractériser le profil clinico biologique des patients MW avec mutation CXCR4 muté. Les mutations de CXCR4 sont associées à un pic monoclonal IgM plus élevé (p=0.006) et à une thrombopénie (p=0.018). Aucun impact en terme de survie globale n’a été observé dans notre cohorte selon le statut mutationnel de CXCR4. Conclusion. Notre étude a permis de décrire de nouvelles mutations de CXCR4 dans la MW et d’identifier une signature génomique plus complexe associée dans les MW CXCR4 muté parmi les MW MYD88L265P. Cette analyse des mutations de CXCR4 a d’autre part montré l’existence d’une hétérogénéité intra-clonal (dans le clone muté MYD88 et CXCR4) et interclonal (mutations du BCR et de CXCR4 dans le groupe des WM mutés MYD88L265P). Nos résultats suggèrent donc l’existence de différents sous groupes génomiques dans la MW