Determination of the stability of cosmetic formulations with incorporation of natural products

Mestrado com dupla diplomação com o High Institute of Biotechnology of Monastir (ISBM), TunisiaNowadays, natural products are gaining increased popularity as cosmetic ingredients due to their active properties and the different roles they can play in a single cosmetic formula, acting as moisturizers, fragrances, surfactants and preservatives. The aim of this study is to formulate and subsequently evaluate the stability of an anti-aging gel based on natural products namely, bee pollen and essential oils from two species of thymus, Portuguese species Thymus zygis subsp zygis and Tunisian species Thymus capitatus applied as natural preservatives. The stability of the cosmetic formulations was evaluated through a series of physicochemical assays, such as pH, density and viscosity determinations, thermic stress tests, evaluation of the organoleptic characteristics (odor, color and general aspect), UV spectrophotometric analysis, centrifuge test, test of vibration, and also through light test. The formulation also evaluated for its resistance and activity against a variety of microorganisms such as: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Candida albicans. The microbiological stability of the formulations was evaluated through agar diffusion assays using cultures of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, and Pseudomonas aeruginosa. The safety of the formulations were evaluated through the determination of the acute toxicity of the compounds incorporated in the base formulation using brine shrimp (Artemia salina) mobility assay and also through the evaluation of their ocular irritancy using Hen's egg-test on the chorioallantoic membrane test (HET-CAM test). The cosmetic formulations prepared presented a pH value that seems adequate for topic application, and presented a non-Newtonian flow behaviour (shear thinning), which is frequently observed in cosmetic products, besides evidencing no phase separation after centrifuge except the formulation containing methylparaben and bee pollen. No phase separation in all the formulations tested during the vibration test. Organoleptic stability of the formulations was achieved during 2 weeks. The results presented in this study showed good stability throughout the experimental period. All the formulations tested showed a good physical and chemical stability. In addition, the findings suggested that the gel formulations with higher concentration of thyme oils and/or methylparaben have apromising antibacterial Abstract xiii effect against the proliferation of various microorganisms namely S. aureus, P. aeruginosa, E. coli and C. albicans evidencing bacteriostatic effect. S. aureus was the most sensitive bacteria with an inhibition zone ranging from 10 to 25 mm. Moreover, it was observed that the formulations in which bee pollen and thyme oils were incorporated did not caused any irritant reaction on the chorioallantoic membrane of chicken embryo. Also, the previous cited products did not show a toxic effect through Artemia assay with LC50 higher than 1mg/mL (1.88 g/mL, 1.94 g/mL, and 17.78 g/mL for Thymus zygis zygis essential oil, Thymus capitatus essential oil, and for bee pollen, respectively). Therefore, the tests performed suggested that the various cosmetic formulations prepared through the incorporation of bee pollen, Thymus zygis zygis and Thymus capitatus essential oils present characteristics suitable for topic use. Also, the incorporation of the natural products did not seem to influence negatively the stability of the cosmetic formulations. During the present work, it was consistently observed a fungal contamination of the cosmetic formulations based on bee pollen. Different methodologies, such as aseptic practices, freeze-drying and heat treatment were used to overcome it. However only by increasing the preservatives concentration, a decrease in fungi growth was registered.Atualmente os produtos naturais estão a crescer em popularidade como ingredientes de cosméticos, devido ás suas propriedades ativas, e também, porque podem desempenhar diferentes papéis nas formulações cosméticas, podendo atuar como hidratantes, fragâncias, surfactantes e conservantes. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma formulação de um gel anti-idadee subsequentemente avaliá-la em termos de estabilidade. O gel foi desenvolvido utilizando como princípios ativosprodutos naturais: pólen de abelha e óleos essenciais de duas plantas do género Thymus, uma espécie Portuguesa,característica da zona de Trás os Montes, Thymus zygis zygis, e uma espécie da flora Tunisina, o Thymus capitatus, que foram usados como conservantes naturais. A estabilidade desta formulação cosmética foi avaliada através de uma série de ensaios físico-químicos, como determinações do pH, da densidade e da viscosidade, testes de stresse de temperatura (temperaturas elevadas por períodos de tempo específicos), avaliações das características organolépticas (odor, cor e aspecto geral), análises de espectrofotometria, teste de centrifugação, teste de vibração, Adicionalmente, a estabilidade microbiológica da formulação foi avaliadaatravés de ensaios de difusão em agar, recorrendo à utilização de culturas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Pseudomonas aeruginosa. A formulação foi também avaliada quanto àresistência e actividade contra alguns microorganismos da pele como: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans. A toxicidade aguda dos compostos incorporados na formulação foi determinada através da avaliação da mobilidade da Artemia salina e a irritabilidade ocular foi avaliada usando o teste de HET- CAM. O pH da formulação desenvolvida apresenta valores adequadosà utilização tópica, e apresenta um comportamento de fluxo não-Newtoniano (reofluidificante), que é frequentemente observado em produtos cosméticos, assim como não apresentou separação de fases nos testes de centrifugação e de vibração, exceto a formulação contendo metilparabeno e pólen de abelha. Sem separação de fases em todas as formulações testadas durante os testes de vibração. A estabilidade organoléptica das formulações manteve-se durante as 2 semanas testadas. Os resultados apresentados neste estudo apresentaram boa estabilidade ao longo do Resumo xv período experimental. Todas as formulações testadas apresentaram boa estabilidade física e química. Em acréscimo, os resultados sugeriram que as formulações de gel com maior concentração de óleo de tomilho e/ou metilparabeno possuem atividade antibacterianas contra a proliferação de vários microrganismos, como S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e C. albicans que evidenciam efeito bacteriostático. S. aureus foi a bactéria mais sensível com uma zona de inibição variando de 10 a 25 mm. Observou-se que as formulações nas quais o pólen de abelha e os óleos de tomilho foram incorporados não provocaram qualquer reação irritante na membrana corioalantóica do embrião de frango. Verificou-se ainda que, os produtos citados anteriormente não mostraram efeito tóxico (toxicidade aguda) através do teste de Artemia com CL50 superior a 1 mg/mL (1,88 g/ mL; 1,94 g/mL e 17,78 g/mL para óleo essencial de Thymus zygis zygis, óleo essencial Thymus capitatus, e para o pólen de abelha, respectivamente). Assim sendo, os resultados obtidos sugerem que, as formulações cosméticas preparadas através da incorporação do pólen de abelha e óleos essenciais, apresentam características adequadas para uso tópico. Além disso, a incorporação dos produtos naturais não pareceu influenciar, negativamente, a estabilidade das formulações cosméticas. Durante o presente trabalho, observou-se consistentemente uma contaminação por fungos das formulações cosméticas à base de pólen de abelha. Foram utilizadas diferentes metodologias, como práticas de assepsia, liofilização e tratamento térmico (pasteurização) para ultrapassa-la. No entanto, apenas aumentando a concentração de conservantes, foi registaada uma diminuição no crescimento de fungos